吳宸印， 徐彥軍， 田浩原

(貴州大學(xué)食用菌研究院， 貴陽 550025)

茯苓[Wolfiporiacocos(Schwein.)Ryvarden&Gilb]為擔(dān)子菌門多孔菌目多孔菌科沃菲臥孔菌屬的腐生(兼寄生)真菌，生于海拔1 800 m以下的松林灌叢，寄生于松科植物赤松或馬尾松等樹根上。根據(jù)地理分布不同分為云苓、安苓、閩苓、川苓等[1-2]，是我國傳統(tǒng)的食、藥兩用菌。合適的碳氮比是食用菌高產(chǎn)的前提[3-4]，單一培養(yǎng)基易加速菌種老化、退化，是限制茯苓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[5]。本課題研究不同配方母種、原種培養(yǎng)基對茯苓菌株菌絲生長農(nóng)藝形狀的影響，選擇適合茯苓栽培的培養(yǎng)基配方，以期促進(jìn)茯苓菌種擴(kuò)繁、栽培推廣進(jìn)程，為創(chuàng)新利用菌物資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

野生茯苓菌核挖取于貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣羊場鎮(zhèn)龍洞村，在鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣黔康源生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司進(jìn)行菌種分離，在貴州大學(xué)食用菌研究院實驗室純化培養(yǎng)，然后在鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣清溪鎮(zhèn)進(jìn)行栽培試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1母種培養(yǎng)基配方

1) 碳源培養(yǎng)基

配方1：胡蘿卜50 g、葡萄糖5 g、磷酸二氫鉀0.75 g、硫酸鎂0.38 g、瓊脂5 g、水250 mL。

配方2：馬鈴薯50 g、葡萄糖5 g、磷酸二氫鉀0.75 g、硫酸鎂0.38 g、瓊脂5 g、水250 mL。

配方3：芋頭50 g、葡萄糖5 g、磷酸二氫鉀0.75 g、硫酸鎂0.38 g、瓊脂5 g、水250 mL。

配方4：番薯50 g、葡萄糖5 g、磷酸二氫鉀0.75 g、硫酸鎂0.38 g、瓊脂5 g、水250 mL。

2) 氮源培養(yǎng)基配方

配方1：酵母膏0.13 g、玉米粉6.25 g、葡萄糖5 g、瓊脂5 g、水250 mL。

配方2：蛋白胨0.13 g、玉米粉6.25 g、葡萄糖5 g、瓊脂5 g、水250 mL。

配方3：硫酸銨0.13 g、玉米粉6.25 g、葡萄糖5 g、瓊脂5 g、水250 mL。

配方4：尿素0.13 g、玉米粉6.25 g、葡萄糖5 g、瓊脂5 g、水250 mL。

培養(yǎng)基自然pH值，120 ℃、0.11 MP高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻到30 ℃以下后接種，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)。每個配方5支試管，3次重復(fù)，共60支試管。

1.2.2原種培養(yǎng)基配方

1) 碳源培養(yǎng)基

配方1：松木屑35%、麥粒45%、麥麩20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方2：松木屑50%、麥粒30%、麥麩20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方3：松木屑65%、麥粒15%、麥麩20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方4：松木屑80%、麥麩20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

2) 氮源培養(yǎng)基

配方1：松木屑35%、麥粒45%、豆餅粉20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方2：松木屑35%、麥粒45%、麥麩20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方3：松木屑35%、麥粒45%、油菜餅20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方4：松木屑35%、麥粒45%、玉米面20%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

原種培養(yǎng)基含水量60%，自然pH值。用聚丙烯菌種袋(15 cm×30 cm×5 cm，干料每袋500 g)裝袋，126 ℃、0.15 MP高壓蒸汽滅菌2 h，冷卻到30 ℃以下后接種茯苓母種，置于25 ℃避光培養(yǎng)。每個處理3個重復(fù)，每次重復(fù)5袋，共60袋。

1.2.3栽培種配方

配方1：松木屑65%、麥粒10%、麥麩20%、玉米面5%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方2：松木屑65%、麥粒10%、麥麩20%、豆餅粉5%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方3：松木屑75%、麥麩15%、油菜餅10%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

配方4： 松木屑75%、麥麩15%、玉米面10%、石膏1%、過磷酸鈣0.5%、糖0.5%、尿素0.5%。

按配方稱料、拌料，用15 cm×30 cm×5 cm聚丙烯菌袋裝袋(干料每袋500 g)，用機(jī)械免鍋爐滅菌鍋LGB-1500*4500滅菌2 h，冷卻至30 ℃以下，接入茯苓原種置于25 ℃避光培養(yǎng)，至菌絲滿袋。每個處理接種6袋，3次重復(fù)，共72袋。

采用松蔸栽培法，選樹樁直徑20～30 cm，每個樹樁接種2袋，共接種36個樹樁。接種后，溫度維持在28～30 ℃，空氣相對濕度70%～80%，土壤濕度控制在20%～25%之間，覆蓋黑膜遮光培養(yǎng)。

1.3 項目測定

1.3.1不同配方培養(yǎng)基菌絲生長情況

觀察并記錄母種、原種、栽培種不同碳氮營養(yǎng)培養(yǎng)基中茯苓菌絲的生長狀況，菌絲色澤，濃密粗細(xì)，整齊度，以及長滿時間等；采用劃線法測量菌絲生長速度；在茯苓菌核成熟期及時采收，記錄各處理菌核產(chǎn)量。

菌絲體生長速率(cm·d-1)=菌絲體長度(cm)/菌絲生長期(d)；

菌核產(chǎn)量(kg·蔸-1)=試驗小區(qū)總產(chǎn)量(kg)/接種樹樁(蔸)。

1.3.2數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件和SPSS 25.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種培養(yǎng)基菌絲生長情況

由表1可知，不同碳源配方母種培養(yǎng)基菌絲生長速度快慢順序為：配方3(1.366 cm·d-1)>配方2(1.226 cm·d-1)>配方4(1.116 cm·d-1)>配方1(0.963 cm·d-1)，配方3菌絲生長速度最快且與配方1、配方4均達(dá)到顯著差異；配方2和配方3菌絲生長勢強(qiáng)，生長速度無顯著性差異，均表現(xiàn)為潔白，濃密，粗壯，菌絲滿管時間最短(10 d)；配方1菌絲生長勢弱，生長速度慢，菌絲偏灰，稀疏，稍細(xì)，滿管時間最長(12 d)。結(jié)果表明，茯苓菌絲在芋頭、馬鈴薯作為茯苓母種培養(yǎng)基上生長表現(xiàn)好，而在胡蘿卜、番薯母種培養(yǎng)基上生長表現(xiàn)較差，以芋頭、馬鈴薯作為母種培養(yǎng)基有機(jī)碳源，比胡蘿卜和番薯作為母種培養(yǎng)基碳源更有利于茯苓菌絲生長。

表1 母種不同碳源培養(yǎng)基菌絲性狀Table 1 Comparison of maternal hyphae traits on different carbon source media

0.01水平上有極顯著差異。下同。

由表2可知，不同氮源配方母種培養(yǎng)基菌絲生長速度快慢順序為：配方1(1.236 cm·d-1)> 配方2(1.169 cm·d-1)> 配方3(1.067 cm·d-1)>配方4(0.962 cm·d-1)，但不同處理菌絲生長速度未達(dá)顯著性差異。配方1和配方2茯苓菌絲生長勢強(qiáng)，配方4長勢較差，菌絲稀疏且稍細(xì)。表明各配方培養(yǎng)基氮源均能滿足茯苓菌絲正常生長，但以酵母膏和蛋白胨表現(xiàn)較好，硫酸銨、尿素為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長勢稍差。菌絲滿管所需時間順序為：配方1<配方2<配方3=配方4，以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基菌絲滿管所需時間最少(10 d)。

2.2 原種培養(yǎng)基菌絲生長情況分析

由表3可知，在菌絲長勢上，配方3和配方4茯苓菌絲表現(xiàn)最好，均為菌絲潔白濃密粗壯；配方2表現(xiàn)次之；配方1表現(xiàn)最差，菌絲潔白，稀疏，稍細(xì)。配方4菌絲滿袋時間最短(27 d)，配方1所需時間最長(31 d)。菌絲生長速度：配方4>配方3>配方2>配方1，配方4分別與配方2、配方1和配方3達(dá)極顯著差異。試驗表明，隨著培養(yǎng)料中松木屑含量增加，處理間表現(xiàn)出菌絲生長速率加快和菌絲滿袋時間減少的趨勢，表明茯苓菌絲對松木材料很強(qiáng)的嗜好性，松木屑較適宜作為茯苓菌種培養(yǎng)的碳源。

表2 母種不同氮源培養(yǎng)基菌絲性狀Table 2 Comparison of maternal hyphae traits on different nitrogen source media

表3 原種不同碳源培養(yǎng)基菌絲生長情況Table 3 Comparision of mycelial growth of protospecies on different carbon source media

由表4可知，玉米面作為氮源的配方4培養(yǎng)料茯苓菌絲潔白、濃密、粗壯，生長速度相對最快，滿袋時間30 d，比以油菜餅作為氮源的配方3培養(yǎng)料菌絲滿袋時間縮短了4 d；配方4菌絲生長速度與配方2差異不顯著，而與配方1、配方3存在顯著差異。玉米面、麥麩比豆餅、油菜餅作為氮源菌絲生長勢更好，更利于茯苓菌絲對氮元素的吸收利用。

表4 原種不同氮源培養(yǎng)基菌絲生長情況Table 4 Comparision of mycelial growth of protospecies on different nitrogen source media

2.3 不同配方栽培種茯苓菌核產(chǎn)量情況分析

由表5可知，不同配方栽培種茯苓菌核產(chǎn)量大小順序為：配方1>配方2>配方4>配方3，配方1、配方2和配方4間菌核產(chǎn)量無顯著性差異。配方1、配方2茯苓菌核產(chǎn)量較高，配方3菌核產(chǎn)量較低；配方1、配方2分別和配方3菌核產(chǎn)量達(dá)極顯著差異，配方3和配方4間菌核產(chǎn)量差異不顯著。表明在栽培種配方中增加麥粒、玉米面、豆餅粉用量，對于保證茯苓菌核產(chǎn)量有積極作用，而未加麥粒且使用油菜餅部分替代麥麩和玉米面作為氮源，茯苓菌核產(chǎn)量有所降低。

表5 不同配方栽培種茯苓產(chǎn)量情況Table 5 Yield comparison of different cultivars with different formulations on P. cocos production

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯、芋頭作為母種培養(yǎng)基有機(jī)碳源，比胡蘿卜和番薯作為母種培養(yǎng)基碳源更有利于茯苓菌絲生長。

茯苓菌絲在酵母膏和蛋白胨作為母種培養(yǎng)基中生長勢強(qiáng)于硫酸銨、尿素為氮源的培養(yǎng)基。

茯苓菌絲對松木材料有很強(qiáng)的嗜好性，隨著培養(yǎng)料中松木屑含量增加，茯苓菌絲表現(xiàn)出生長速率加快和菌絲滿袋時間減少的趨勢。以松木屑作為原種、栽培種培養(yǎng)基碳源，茯苓菌絲生長良好，菌核產(chǎn)量高，這與陳秀虎等[6]研究結(jié)果基本一致。

煮熟的麥粒，茯苓菌絲可以直接吸收利用，不需經(jīng)過胞外酶分解再吸收的過程[7]。本試驗在栽培種配方中增加麥粒、玉米面、豆餅粉用量，對于保證茯苓菌核產(chǎn)量有積極作用。

玉米面、麥麩作為原種、栽培種氮源比豆餅、油菜餅作為氮源，更利于茯苓菌絲的吸收利用。