鄧必高，鄭曉鑄，高偉忠，張?jiān)骑w

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，重慶 401120；2.遵義市第一人民醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)由外傷、高血壓、腦動(dòng)脈畸形及動(dòng)脈瘤等因素誘發(fā)造成，一般發(fā)病較急，伴隨腦膜刺激征、局灶神經(jīng)功能缺損體征等腦損傷征象的出現(xiàn)，具有較高的死亡率和致殘率。早期盡快地實(shí)施腦保護(hù)，有利于改善手術(shù)患者的預(yù)后，以及降低死亡率。有研究表明，SAH后腦水腫、血腦屏障破壞、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和損傷等病理生理學(xué)變化，是導(dǎo)致早期腦損傷的主要原因[1]。

α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑——鹽酸右美托咪定(Dex)，主要用于臨床麻醉鎮(zhèn)靜。有研究表明，Dex不僅能提高手術(shù)患者對(duì)氣管插管的耐受，穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)，而且對(duì)膿毒癥和缺血-再灌注等腦損傷具有一定的抗炎、神經(jīng)保護(hù)作用[1]。Dex能否通過影響p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生腦保護(hù)作用，目前尚不清楚。本研究擬探討Dex預(yù)處理對(duì)大鼠早期腦損傷過程中可能產(chǎn)生的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 2019年12月選取健康清潔級(jí)SD大鼠72只，不限雌雄，體重220～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0001]。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(C組)、SAH組(S組)和SAH聯(lián)合Dex預(yù)處理組(D組)，每組24只。按處死時(shí)間6、24、48、72 h將3組大鼠分別分為4個(gè)亞組,每組6只。

1.2方法

1.2.1SAH模型制備 大鼠稱重、麻醉，仰臥位固定，行頸正中偏右切口，分離右頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，鉗夾頸總、頸內(nèi)動(dòng)脈,結(jié)扎頸外動(dòng)脈后移開頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈鉗，用50 mm尼龍線推入頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段，遇阻力后將尼龍線再向前推進(jìn)1～2 mm，刺破血管。移除尼龍線并結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端,解除頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈鉗，恢復(fù)血流，縫合切口。S、D組建立SAH模型，C組僅將尼龍線推入頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段不穿破血管。造模后腹腔注射Dex注射液50 μg/kg(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：19042232)，S組腹腔注射等體積生理鹽水,C組不給予干預(yù)。

1.2.2標(biāo)本采集及處理 于6、24、48、72 h麻醉后分別處死3組大鼠中的6只，快速取出腦組織，切片、固定，石蠟包埋切片后用于蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫組織化學(xué)(免疫組化)檢測(cè)；同時(shí)迅速取額葉皮質(zhì)組織置于-80 ℃冰箱低溫保存，用于Western blot檢測(cè)；其余腦組織用于含水量檢測(cè)。

1.2.3腦組織含水量測(cè)定 取新鮮腦組織，用濾紙蘸干表面血跡，電子天平稱濕重，置105 ℃烘箱中烘烤24 h后取出稱干重，腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.2.4免疫組化法檢測(cè)p38MAPK、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá) 取石蠟切片、脫蠟，清水沖洗，3%過氧化氫浸泡10 min，除去內(nèi)源性過氧化氫酶，蒸煮、冷卻，暴露抗原位點(diǎn)，進(jìn)行血清封閉，分別加p38MAPK、IL-1β、TNF-α多克隆抗體(1∶100，購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司)4 ℃冰箱過夜，第2天水浴復(fù)溫后加二抗，然后置于37 ℃溫箱中30 min，加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)、加顯色劑，并進(jìn)行復(fù)染、脫水、封片。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液代替一抗。顯微鏡下觀察陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染色呈棕黃色。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)視野陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

1.2.5Western blot法檢測(cè)p38MAPK表達(dá) 取新鮮腦組織2 mg進(jìn)行細(xì)胞蛋白抽提，加裂解工作液重懸細(xì)胞沉淀，置冰上10 min，其間振蕩2～3次，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)到小離心管中，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，封閉，加p38MAPK多克隆抗體孵育，洗膜后加二抗(過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G，購(gòu)于美國(guó)Pierce公司)孵育，再次洗膜，最后進(jìn)行曝光、成像。內(nèi)對(duì)照為β-actin。膠片掃描、成像，應(yīng)用Quantity One4.6.2軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠24 h腦組織光鏡檢查結(jié)果比較 C組大鼠24 h腦組織神經(jīng)細(xì)胞飽滿無明顯變形，S、D組出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)元數(shù)量減少，部分神經(jīng)細(xì)胞可見空泡樣變和細(xì)胞形態(tài)改變，有明顯的核固縮征象；與S組比較，D組大鼠24 h腦組織損傷較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠24 h腦組織光鏡檢查結(jié)果比較(HE，400×)

2.2各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量比較 S、D組大鼠6、24、48、72 h腦組織含水量均較C組明顯增高，24 h達(dá)高峰，72 h仍在較高水平；D組大鼠腦組織含水量較S組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量比較

2.3各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平比較 C組大鼠6、24、48、72 h p38MAK、IL-1β、TNF-α幾乎無表達(dá)；S、D組大鼠6 h開始即有少量棕黃色著色陽性細(xì)胞表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)，隨時(shí)間增加陽性細(xì)胞著色逐漸加深，可見于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，48 h達(dá)高峰，72 h后逐漸下降；S組大鼠6、24、48、72 h陽性細(xì)胞表達(dá)較D組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平比較

2.4各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)p38MAPK蛋白表達(dá)水平比較 C組大鼠6、24、48、72 h p38MAPK僅少量表達(dá)，S組大鼠6、24、48 h p38MAPK蛋白表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，48 h達(dá)高峰，72 h有所降低；D組大鼠6、24、48、72 h p38MAPK蛋白表達(dá)均較S組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)p38MAPK蛋白表達(dá)水平比較

1.C組；2、4、6、8.S組6、24、48、72 h；3、5、7、9.D組6、24、48、72 h。

3 討 論

本研究成功地建立了大鼠SAH模型，首先從HE染色結(jié)果較為直觀地觀察到了大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞空泡變性、不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，提示發(fā)生了腦損傷。MAPKs家族在細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)功能方面具有重要作用，目前主要有細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)、p38MAPK及BMKI(ERK5)4條通路參與了細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞外信號(hào)刺激MAPKs磷酸化激活，磷酸化MAPKs(p-MAPKs)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，激活細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、炎癥、增殖和凋亡等多種生理過程[2-4]。其中JNK/SAPK、p38MAPK通路與神經(jīng)細(xì)胞凋亡活動(dòng)尤為密切。大腦在創(chuàng)傷、內(nèi)毒素、炎癥、出血、缺血和缺氧等誘因下釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、核因子κB等炎性細(xì)胞因子和大量炎癥細(xì)胞，激活p38MAPK通路，產(chǎn)生細(xì)胞損害。同時(shí)，p38MAPK進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，二者具有協(xié)同作用[5-6]。在腦缺血再灌注損傷早期磷酸化p38MAPK、磷酸化氨基末端蛋白激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶9等明顯升高[7-8]，而后期隨著炎性反應(yīng)及損傷的進(jìn)行性發(fā)展可檢測(cè)出Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)等與凋亡相關(guān)因子的大量表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡和死亡的不可逆改變[9]。本研究分析了大鼠SAH模型p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達(dá)的變化和大鼠腦損傷程度的關(guān)系，結(jié)果顯示，p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達(dá)在大鼠腦損傷6 h開始，隨后逐漸增多，48 h達(dá)高峰，72 h后開始減少。結(jié)合光鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷情況認(rèn)為，p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達(dá)及活化在SAH腦損傷的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，與上述研究結(jié)果相符。

Dex能減輕腦損傷過程中血腦屏障的破壞，降低核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族3炎性小體、caspase-1 p20、IL-1β、IL-6、TNF-α、核因子κB p65的表達(dá)水平，對(duì)腦損傷后的炎性反應(yīng)和凋亡具有明顯的抑制作用[10-11]。有研究表明，在腦缺血再灌注損傷早期Dex能調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌、穩(wěn)定顱內(nèi)壓、減輕腸黏膜損害和維持正常腸通透性，減輕全身炎癥應(yīng)激反應(yīng)，且能在損傷后期減輕細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞，避免急性肺損傷等繼發(fā)性損傷的發(fā)生[12-14]。金峰等[15]發(fā)現(xiàn)，Dex主要通過抑制JNK、p38磷酸化，減少下游caspase-3 的激活，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中凋亡的發(fā)生，發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與S組比較，D組Dex預(yù)處理后大鼠腦水腫明顯減輕，細(xì)胞變性程度較低，說明Dex預(yù)處理在一定程度上通過影響p38MAPK磷酸化，從而發(fā)揮了腦保護(hù)作用。

綜上所述，推測(cè)Dex預(yù)處理減輕大鼠SAH腦損傷的機(jī)制可能與其抑制IL-1β、TNF-α等炎性細(xì)胞因子激活和下調(diào)p38MAPK磷酸化，減輕炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其詳細(xì)分子機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究探討。對(duì)Dex神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行深入研究可為Dex的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。