鄧必高，鄭曉鑄，高偉忠，張云飛

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，重慶 401120；2.遵義市第一人民醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)由外傷、高血壓、腦動脈畸形及動脈瘤等因素誘發(fā)造成，一般發(fā)病較急，伴隨腦膜刺激征、局灶神經(jīng)功能缺損體征等腦損傷征象的出現(xiàn)，具有較高的死亡率和致殘率。早期盡快地實施腦保護，有利于改善手術(shù)患者的預后，以及降低死亡率。有研究表明，SAH后腦水腫、血腦屏障破壞、神經(jīng)細胞的凋亡和損傷等病理生理學變化，是導致早期腦損傷的主要原因[1]。

α2-腎上腺素受體激動劑——鹽酸右美托咪定(Dex)，主要用于臨床麻醉鎮(zhèn)靜。有研究表明，Dex不僅能提高手術(shù)患者對氣管插管的耐受，穩(wěn)定血流動力學，而且對膿毒癥和缺血-再灌注等腦損傷具有一定的抗炎、神經(jīng)保護作用[1]。Dex能否通過影響p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號轉(zhuǎn)導通路產(chǎn)生腦保護作用，目前尚不清楚。本研究擬探討Dex預處理對大鼠早期腦損傷過程中可能產(chǎn)生的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1研究對象 2019年12月選取健康清潔級SD大鼠72只，不限雌雄，體重220～250 g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2007-0001]。采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(C組)、SAH組(S組)和SAH聯(lián)合Dex預處理組(D組)，每組24只。按處死時間6、24、48、72 h將3組大鼠分別分為4個亞組,每組6只。

1.2方法

1.2.1SAH模型制備 大鼠稱重、麻醉，仰臥位固定，行頸正中偏右切口，分離右頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，鉗夾頸總、頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸外動脈后移開頸內(nèi)動脈上的動脈鉗，用50 mm尼龍線推入頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段，遇阻力后將尼龍線再向前推進1～2 mm，刺破血管。移除尼龍線并結(jié)扎頸外動脈殘端,解除頸總動脈的動脈鉗，恢復血流，縫合切口。S、D組建立SAH模型，C組僅將尼龍線推入頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段不穿破血管。造模后腹腔注射Dex注射液50 μg/kg(揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號：19042232)，S組腹腔注射等體積生理鹽水,C組不給予干預。

1.2.2標本采集及處理 于6、24、48、72 h麻醉后分別處死3組大鼠中的6只，快速取出腦組織，切片、固定，石蠟包埋切片后用于蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫組織化學(免疫組化)檢測；同時迅速取額葉皮質(zhì)組織置于-80 ℃冰箱低溫保存，用于Western blot檢測；其余腦組織用于含水量檢測。

1.2.3腦組織含水量測定 取新鮮腦組織，用濾紙蘸干表面血跡，電子天平稱濕重，置105 ℃烘箱中烘烤24 h后取出稱干重，腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.2.4免疫組化法檢測p38MAPK、白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達 取石蠟切片、脫蠟，清水沖洗，3%過氧化氫浸泡10 min，除去內(nèi)源性過氧化氫酶，蒸煮、冷卻，暴露抗原位點，進行血清封閉，分別加p38MAPK、IL-1β、TNF-α多克隆抗體(1∶100，購于美國Bioworld公司)4 ℃冰箱過夜，第2天水浴復溫后加二抗，然后置于37 ℃溫箱中30 min，加鏈霉親和素-生物素復合物(試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司)、加顯色劑，并進行復染、脫水、封片。陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗。顯微鏡下觀察陽性表達為細胞質(zhì)或細胞核染色呈棕黃色。應用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測定每個視野陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

1.2.5Western blot法檢測p38MAPK表達 取新鮮腦組織2 mg進行細胞蛋白抽提，加裂解工作液重懸細胞沉淀，置冰上10 min，其間振蕩2～3次，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)到小離心管中，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，封閉，加p38MAPK多克隆抗體孵育，洗膜后加二抗(過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G，購于美國Pierce公司)孵育，再次洗膜，最后進行曝光、成像。內(nèi)對照為β-actin。膠片掃描、成像，應用Quantity One4.6.2軟件進行蛋白條帶灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠24 h腦組織光鏡檢查結(jié)果比較 C組大鼠24 h腦組織神經(jīng)細胞飽滿無明顯變形，S、D組出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，神經(jīng)元數(shù)量減少，部分神經(jīng)細胞可見空泡樣變和細胞形態(tài)改變，有明顯的核固縮征象；與S組比較，D組大鼠24 h腦組織損傷較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠24 h腦組織光鏡檢查結(jié)果比較(HE，400×)

2.2各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較 S、D組大鼠6、24、48、72 h腦組織含水量均較C組明顯增高，24 h達高峰，72 h仍在較高水平；D組大鼠腦組織含水量較S組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較

2.3各組大鼠不同時間點p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達水平比較 C組大鼠6、24、48、72 h p38MAK、IL-1β、TNF-α幾乎無表達；S、D組大鼠6 h開始即有少量棕黃色著色陽性細胞表達，主要位于細胞質(zhì)，隨時間增加陽性細胞著色逐漸加深，可見于細胞質(zhì)和細胞核中，48 h達高峰，72 h后逐漸下降；S組大鼠6、24、48、72 h陽性細胞表達較D組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達水平比較

2.4各組大鼠不同時間點p38MAPK蛋白表達水平比較 C組大鼠6、24、48、72 h p38MAPK僅少量表達，S組大鼠6、24、48 h p38MAPK蛋白表達呈逐漸增強趨勢，48 h達高峰，72 h有所降低；D組大鼠6、24、48、72 h p38MAPK蛋白表達均較S組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠不同時間點p38MAPK蛋白表達水平比較

1.C組；2、4、6、8.S組6、24、48、72 h；3、5、7、9.D組6、24、48、72 h。

3 討 論

本研究成功地建立了大鼠SAH模型，首先從HE染色結(jié)果較為直觀地觀察到了大鼠腦組織神經(jīng)細胞空泡變性、不同程度炎癥細胞浸潤等，提示發(fā)生了腦損傷。MAPKs家族在細胞內(nèi)外信號傳導功能方面具有重要作用，目前主要有細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶/應激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)、p38MAPK及BMKI(ERK5)4條通路參與了細胞外信號傳導，細胞外信號刺激MAPKs磷酸化激活，磷酸化MAPKs(p-MAPKs)轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，激活細胞核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，從而參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、炎癥、增殖和凋亡等多種生理過程[2-4]。其中JNK/SAPK、p38MAPK通路與神經(jīng)細胞凋亡活動尤為密切。大腦在創(chuàng)傷、內(nèi)毒素、炎癥、出血、缺血和缺氧等誘因下釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、核因子κB等炎性細胞因子和大量炎癥細胞，激活p38MAPK通路，產(chǎn)生細胞損害。同時，p38MAPK進一步促進炎性細胞因子表達，二者具有協(xié)同作用[5-6]。在腦缺血再灌注損傷早期磷酸化p38MAPK、磷酸化氨基末端蛋白激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶9等明顯升高[7-8]，而后期隨著炎性反應及損傷的進行性發(fā)展可檢測出Bax、B淋巴細胞瘤-2基因和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)等與凋亡相關(guān)因子的大量表達，產(chǎn)生細胞凋亡和死亡的不可逆改變[9]。本研究分析了大鼠SAH模型p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達的變化和大鼠腦損傷程度的關(guān)系，結(jié)果顯示，p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達在大鼠腦損傷6 h開始，隨后逐漸增多，48 h達高峰，72 h后開始減少。結(jié)合光鏡下觀察神經(jīng)細胞損傷情況認為，p38MAPK、IL-1β、TNF-α表達及活化在SAH腦損傷的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，與上述研究結(jié)果相符。

Dex能減輕腦損傷過程中血腦屏障的破壞，降低核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族3炎性小體、caspase-1 p20、IL-1β、IL-6、TNF-α、核因子κB p65的表達水平，對腦損傷后的炎性反應和凋亡具有明顯的抑制作用[10-11]。有研究表明，在腦缺血再灌注損傷早期Dex能調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌、穩(wěn)定顱內(nèi)壓、減輕腸黏膜損害和維持正常腸通透性，減輕全身炎癥應激反應，且能在損傷后期減輕細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞，避免急性肺損傷等繼發(fā)性損傷的發(fā)生[12-14]。金峰等[15]發(fā)現(xiàn)，Dex主要通過抑制JNK、p38磷酸化，減少下游caspase-3 的激活，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中凋亡的發(fā)生，發(fā)揮腦保護作用。本研究結(jié)果顯示，與S組比較，D組Dex預處理后大鼠腦水腫明顯減輕，細胞變性程度較低，說明Dex預處理在一定程度上通過影響p38MAPK磷酸化，從而發(fā)揮了腦保護作用。

綜上所述，推測Dex預處理減輕大鼠SAH腦損傷的機制可能與其抑制IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子激活和下調(diào)p38MAPK磷酸化，減輕炎性反應和細胞凋亡有關(guān)，但其詳細分子機制尚有待于進一步研究探討。對Dex神經(jīng)保護機制進行深入研究可為Dex的臨床應用提供新的理論依據(jù)。