田東梅，廖海霞，王雪嬌,李亨利，尹 欣，朱明輝

(成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/附屬生殖婦幼醫(yī)院，四川 成都 610000)

京尼平屬環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，由傳統(tǒng)中藥——杜仲等提取的京尼平苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解而成，是一種很好的炎癥抑制劑[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，京尼平在抗腫瘤、抗血栓、抗炎和治療糖尿病等方面均具有顯著療效[2-3]。在生殖內(nèi)分泌疾病中，多囊卵巢綜合征是一種常見疾病，常伴慢性炎癥和氧化應(yīng)激[4-5]。有研究表明，多囊卵巢綜合征患者卵巢組織局部存在慢性炎性反應(yīng)，主要是由于產(chǎn)生了過量的腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等，并激活核因子κB(NF-κB)，從而引發(fā)顆粒細(xì)胞過早凋亡，抑制了優(yōu)勢(shì)卵泡的形成[6]。如何改善多囊卵巢綜合征患者的炎癥狀態(tài)，對(duì)其治療具有積極的意義。本研究利用脂多糖(LPS)模擬了人卵巢顆粒細(xì)胞系(KGN細(xì)胞株)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，探索了京尼平可能的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株來源 KGN細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所王飛教授惠贈(zèng)。

1.1.2試劑與儀器 京尼平為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；CCK-8為日本同仁化學(xué)研究生產(chǎn)品，雌激素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自貝斯維斯公司，線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)、NF-κB抗體購自proteintech，17α羥化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)抗體購自affinity，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基/F12培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司，電泳儀(型號(hào)Power Pac Basic)、酶標(biāo)儀(型號(hào)iMarkTMMicroplate reader)均購自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 KGN細(xì)胞株培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μ/mL鏈霉素，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)加入2 μg/mL的LPS建立氧化應(yīng)激狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入不同質(zhì)量濃度的京尼平進(jìn)行干預(yù)。設(shè)置空白對(duì)照組(添加相應(yīng)劑量溶劑二甲基亞砜的DMEM/F12培養(yǎng)基)、LPS組和LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組。

1.2.2KGN細(xì)胞株活性檢測(cè) 不同質(zhì)量濃度(0、0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L)京尼平處理KGN細(xì)胞株，干預(yù)0、12、24、36、48 h后每孔加入CCK-8溶液10 mL再孵育1 h；在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)光密度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每次設(shè)立5個(gè)復(fù)孔。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)不同質(zhì)量濃度京尼平干預(yù)24 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6水平。設(shè)置空白孔、空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣品孔?？瞻卓住⒖瞻讓?duì)照孔不加樣品，只加顯色劑A、B和終止液用于調(diào)零；標(biāo)準(zhǔn)品孔加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，后加入辣根過氧化物酶100 μL；樣品孔加入樣本50 μL后加入辣根過氧化物酶100 μL，37 ℃溫育60 min。每孔加滿洗滌液，靜置1 min后棄上清液，重復(fù)洗滌5次，拍干后每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，依序測(cè)量各孔450 nm波長(zhǎng)OD值，計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)KGN細(xì)胞株UCP2、NF-κB、CYP19A1、CYP17A1蛋白表達(dá) 采用RIPA 蛋白裂解液提取各組KGN細(xì)胞株總蛋白，采用BCA法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。上樣量根據(jù)測(cè)得的蛋白濃度計(jì)算，確保每孔上樣量相同，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺120 V電泳，低溫轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加對(duì)應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h，充分洗滌后采用超敏化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進(jìn)行顯影，反應(yīng)5 min后開始膠片曝光。蛋白表達(dá)量用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin的OD值比值表示。

2 結(jié) 果

2.1不同質(zhì)量濃度京尼平對(duì)KGN細(xì)胞株活性的影響 與空白對(duì)照組比較，LPS+0.5 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株生長(zhǎng)受到明顯抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨時(shí)間增加，LPS+0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞數(shù)量越來越少。見圖1。

與LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組比較，aP<0.05。

2.2不同質(zhì)量濃度京尼平對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下雌激素水平，以及IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表達(dá)的影響 各組KGN細(xì)胞株雌激素水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LPS組比較，空白對(duì)照組KGN細(xì)胞株IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β表達(dá)均明顯降低，LPS+0.05、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株IL-4表達(dá)均明顯降低，LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株IL-5表達(dá)均明顯降低，LPS+0.30 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株IL-1β表達(dá)明顯降低，LPS+0.20、0.30 mmol/L京尼平組IL-6表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組KGN細(xì)胞株CYP17A1、CYP19A1、UCP2、NF-κB蛋白表達(dá)比較 與LPS組比較，空白對(duì)照組KGN細(xì)胞株UCP2、NF-κB蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株UCP2蛋白表達(dá)均略有下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細(xì)胞株NF-κB蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LPS+0.05 mmol/L京尼平組細(xì)胞株NF-κB蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組間KGN細(xì)胞株NF-κB蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組KGN細(xì)胞株CYP17A1、CYP19A1蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

氧化應(yīng)激作為機(jī)體氧化還原反應(yīng)失衡的直接表現(xiàn)，活性氧濃度升高，超出內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，最終導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。氧化應(yīng)激參與精卵和胚胎的重要生理活動(dòng)，當(dāng)其濃度失控時(shí)會(huì)損害精子、卵子和胚胎質(zhì)量，使受孕失敗[7]。因此，最大限度地避免產(chǎn)生過量活性氧至關(guān)重要。臨床對(duì)改善女性生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激的藥物較少，作用機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，京尼平在抗炎和治療糖尿病等方面療效顯著[2-3]。而京尼平在生殖系統(tǒng)方面的研究較少。本研究從分子水平了解了在LPS誘導(dǎo)KGN細(xì)胞株氧化應(yīng)激狀態(tài)下京尼平的抗炎作用。

3.1京尼平對(duì)常規(guī)條件下培養(yǎng)的KGN細(xì)胞株活力的影響 本研究結(jié)果顯示，京尼平質(zhì)量濃度為0.05 mmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，京尼平質(zhì)量濃度大于或等于0.10 mmol/L時(shí)KGN細(xì)胞株出現(xiàn)明顯抑制，且隨質(zhì)量濃度增加抑制作用更明顯，京尼平質(zhì)量濃度大于或等于0.20 mmol/L時(shí)KGN細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)肉眼可見的減少，說明京尼平質(zhì)量濃度過高時(shí)對(duì)細(xì)胞具有致死性。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，京尼平質(zhì)量濃度過高會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而適當(dāng)質(zhì)量濃度京尼平可緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激而提高其存活率[8-11]。

3.2京尼平對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下KGN細(xì)胞株分泌功能的影響 有研究發(fā)現(xiàn)，京尼平質(zhì)量濃度為50 mmol/L時(shí)能顯著提高3β-羥基類固醇脫氫酶、CYP17A1、17β羥化類固醇脫氫酶表達(dá)水平，從而促進(jìn)睪酮和雌二醇合成[12]。本研究結(jié)果顯示，各組KGN細(xì)胞株CYP17A1、CYP19A1蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組上清液中雌激素水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示炎性狀態(tài)未影響細(xì)胞雌激素分泌，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3京尼平對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下KGN細(xì)胞株的抗炎作用 UCP2在線粒體電子傳遞鏈的能量代謝中發(fā)揮著重要作用，與抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)密切相關(guān)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，UCP2在人卵丘細(xì)胞中表達(dá)，可能參與卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟和質(zhì)量調(diào)控[14]。本研究結(jié)果顯示，添加LPS后UCP2、NF-κB蛋白，以及IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β表達(dá)均明顯增加。炎癥指標(biāo)的明顯增加提示氧化應(yīng)激模型的成功建立。不同質(zhì)量濃度京尼平干預(yù)后IL-4、IL-5表達(dá)均明顯降低，高質(zhì)量濃度京尼平干預(yù)后IL-6、IL-1β表達(dá)均明顯降低，NF-κB蛋白表達(dá)也下降，提示京尼平具有抗炎作用，但不同質(zhì)量濃度京尼平干預(yù)后UCP2蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？赡苡捎诰┠崞讲煌ㄟ^調(diào)節(jié)UCP2蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。已有的研究表明，京尼平能有效抑制LPS引起的KGN細(xì)胞株誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等炎癥因子的表達(dá)[15]，與本研究結(jié)果一致，提示京尼平具有抗炎作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，京尼平可通過阻斷NF-κB減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，從而緩解急性肺損傷[16]。本研究在KGN細(xì)胞株中同樣發(fā)現(xiàn)京尼平可通過阻斷NF-κB蛋白表達(dá)而減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

綜上所述，京尼平可緩解LPS誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞株氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能通過調(diào)節(jié)NF-κB蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用，降低IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β水平。京尼平在氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)雌激素分泌無明顯影響，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。