馮偉 馮雅琪 徐晶雪

摘 要：以大蒜為試驗(yàn)材料，分別采用磷酸緩沖液提取法、熱變性法對(duì)其細(xì)胞溶質(zhì)中的超氧化物歧化酶進(jìn)行提取分離，然后再利用硫酸銨分級(jí)鹽析法對(duì)經(jīng)熱變性和緩沖液抽提所獲得的SOD粗提液進(jìn)行純化，配合透析除去殘留的小分子物質(zhì)，最后通過(guò)測(cè)得的SOD酶活力的大小判斷提取大蒜SOD的最佳方法，并通過(guò)對(duì)2種方法中不同參數(shù)的優(yōu)化，找出最佳提取條件。結(jié)果表明：熱變性法粗提大蒜SOD，透析法配合硫酸銨分級(jí)鹽析法純化SOD為最理想的提純方法。其中熱變性法最適溫度為60℃，磷酸緩沖液浸提法合適的緩沖液pH值為7.8。

關(guān)鍵詞：大蒜;SOD;提取;純化

中圖分類(lèi)號(hào) S633.4;Q55文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）05-0019-03

Abstract： With garlic as experiment material， adopt the phosphate buffer extraction， thermal denaturation of the extraction and separation of the superoxide dismutase （SOD） in the cytosol， and recycled ammonium sulfate salting out method of the thermal denaturation and buffer extraction of crude extract SOD received by purification， cooperate with dialysis to remove residues of small molecules， at last， through the size of the measured SOD enzyme activity， it is concluded that the best way to extract of garlic SOD， and through the optimization of different parameters in two ways， find out the best extraction conditions. The results showed that thermal denaturation method to extract SOD from garlic and dialysis method combined with ammonium sulfate fractional salting out method to purify SOD were the most ideal purification methods， and the optimal temperature of thermal denaturation method was 60℃. The appropriate buffer pH value in the phosphoric acid buffer leaching method is 7.8.

Key words：Garlic; SOD; Extraction; Purification

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase），簡(jiǎn)稱(chēng)SOD，為生物氧化酶類(lèi)的重要成員，有“生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線”之稱(chēng)。SOD由蛋白質(zhì)和不同的金屬輔基組成，廣泛存在于微生物以及動(dòng)物、植物體內(nèi)，能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，屬于金屬酶。根據(jù)SOD所含金屬輔基的不同，目前世界上發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)SOD大致可分為3類(lèi)，分別為Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Fe-SOD[1]。其中，植物體內(nèi)含量最為豐富的一類(lèi)SOD是Cu/Zn-SOD，本研究中的大蒜SOD就屬于這一類(lèi)。

SOD可有效防止機(jī)體內(nèi)氧自由基的損害，避免皮膚受到電離輻射的損傷，可消除體內(nèi)由于生化代謝產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，能有效防止皮膚衰老，同時(shí)還有祛斑、抗皺的功效[5]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，SOD主要用于治療如心肌缺血與缺血再灌注綜合癥、炎癥、腫瘤以及一些自身免疫性疾病等因超氧陰離子傷害引起的疾病。SOD還可作為水果和蔬菜的保鮮劑。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，SOD可以清除逆境下產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，這樣植物的生長(zhǎng)抑制就會(huì)被解除[2]。提高SOD在植物體內(nèi)的表達(dá)程度，就有可能通過(guò)提高植物對(duì)逆境的抵抗能力，進(jìn)一步培育出抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高的新優(yōu)良品種。近年來(lái)，有關(guān)高等植物的SOD研究越來(lái)越受到關(guān)注。從一些高等植物尤其是經(jīng)常食用的瓜果、蔬菜以及野生植物中提取的SOD安全性較高，且植物來(lái)源廣泛，提取成本低。本研究以大蒜為試驗(yàn)材料，對(duì)大蒜的SOD進(jìn)行粗提、純化，比較磷酸緩沖液提取法、熱變性法等提取方法在不同條件下對(duì)SOD酶活力的影響，并鑒定得到的大蒜SOD所屬的類(lèi)型。

1 材料與方法

1.1 SOD的粗提

1.1.1 熱變性法 將大蒜分瓣并切去蒂部，去皮后選擇無(wú)霉斑、無(wú)黃褐斑點(diǎn)的蒜瓣，洗凈晾干，稱(chēng)取250g，將其放入研缽內(nèi)搗碎成蒜泥狀。加入500mL蒸餾水，攪拌充分后4℃條件下靜置一段時(shí)間。用4層紗布過(guò)濾除去雜質(zhì)，并將得到的濾液平均分成5份。在恒溫水浴鍋中分別于45、50、55、60、65℃條件下熱變性20min，10000r/min離心15min。棄沉淀，上清液即是不同熱變性溫度下提取到的粗提液[3]。

1.1.2 磷酸緩沖液提取法 配制不同pH的磷酸緩沖液各100mL，緩沖液濃度要求都是0.05moL/L。通過(guò)改變緩沖液中磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉的比例來(lái)改變其pH值。所配磷酸緩沖液的pH分別為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0。稱(chēng)量 6份去皮洗凈的大蒜瓣，每份為50g，分別放入6個(gè)研缽中。每個(gè)研缽中加入事先配制好的不同pH的磷酸緩沖液各100mL，將其充分研磨（冰鹽浴條件下進(jìn)行），靜置一段時(shí)間后分別用4層紗布過(guò)濾去雜，收集的濾液用冷凍高速離心機(jī)10000r/min離心15min。棄沉淀，上清液即是不同pH的磷酸緩沖液浸提所得的SOD粗提液[3]。

1.2 SOD粗提液的純化

1.2.1 硫酸銨分級(jí)鹽析法 所需固體硫酸銨的量可根據(jù)待純化溶液的體積（mL）和硫酸銨飽和度常用表計(jì)算得到。稱(chēng)取所需的量，將其研磨成粉末狀待用。攪拌得到的粗酶液，同時(shí)加入硫酸銨至飽和度45%，4℃條件下靜置1h，10000r/min冷凍離心15min，棄沉淀，取無(wú)色透明的上清液。繼續(xù)將固體硫酸銨粉末加至上清液中，至最終飽和度為90%，于4℃條件下靜置2h左右，10000r/min冷凍離心15min，收集底部白色沉淀，此沉淀即為純化后的SOD。加入硫酸銨的過(guò)程應(yīng)在冰鹽浴條件下進(jìn)行[4]。

1.2.2 透析法 將經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析法純化得到的SOD沉淀用約1/20原始提取液體積的磷酸二氫鈉溶液溶解，然后用剪刀截取適宜長(zhǎng)度的透析袋，在清水中煮沸5min。將充分溶解的SOD倒入透析袋內(nèi)，在4℃條件下透析過(guò)夜（或透析至無(wú)硫酸根離子檢出），每4h換1次緩沖液。測(cè)SOD酶活力。硫酸根離子可用事先配制好的氯化鋇檢測(cè)，若有硫酸根離子存在，加入氯化鋇后透析袋內(nèi)會(huì)產(chǎn)生白色沉淀[4]。

1.3 SOD酶活力測(cè)定 選擇鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD酶活力[5]。鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基。自氧化反應(yīng)會(huì)因?yàn)镾OD的存在受到一定的抑制。所測(cè)鄰苯三酚自氧化速率越小，說(shuō)明自氧化反應(yīng)中抑制作用越大，即得到的大蒜SOD酶液酶活力越大。SOD酶活力單位定義：在lmL反應(yīng)液中，1min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)到50%的酶量定為1個(gè)活力單位（U）。酶活力的計(jì)算公式如下：

酶活力（U/mL）=[0.07-A325/min0.07×100%50%×n×Vv]

式中：A325：325nm下的OD值;n：樣液稀釋倍數(shù);V：反應(yīng)液總體積（mL）;v：樣液體積（mL）

1.4 SOD酶類(lèi)型鑒定 根據(jù)鄰苯三酚自氧化測(cè)酶活法，采用抑制劑敏感性試驗(yàn)，將本研究最后得到的SOD酶液進(jìn)行酶的類(lèi)型鑒定。SOD的類(lèi)型不同，對(duì)抑制劑氯仿-乙醇和H2O2的敏感性也不同。其中，Cu/Zn-SOD只對(duì)H2O2敏感，對(duì)氯仿-乙醇不敏感;Mn-SOD只對(duì)氯仿-乙醇敏感，對(duì)H2O2不敏感;而Fe-SOD對(duì)H2O2和氯仿-乙醇都敏感[5]。向酶液分別加入0.5mmoL/L、1mmoL/L的氯仿-乙醇和H2O2，15min后測(cè)定酶活，并與室溫酶活進(jìn)行比較，以此判斷SOD酶的類(lèi)型。若兩者都有抑制作用，則為Fe型;若只有H2O2對(duì)其有抑制作用，則為Cu-Zn型;若只有氯仿-乙醇對(duì)其有抑制作用，則為Mn型。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD粗提熱變性法 熱變性法中，測(cè)定變性溫度分別為45、50、55、60、65℃，粗提時(shí)間為1～5min，測(cè)定粗提得到的SOD的光吸收值。由圖1可知，變性溫度為60℃時(shí)自氧化反應(yīng)受到的抑制程度最大，60℃變性處理后OD325為0.015。由此可見(jiàn)，溫度過(guò)高會(huì)影響SOD活性，溫度過(guò)低時(shí)粗酶液中會(huì)殘留較多雜蛋白，最適熱變性溫度為60℃。通過(guò)計(jì)算，60℃條件下經(jīng)過(guò)熱變性處理最終粗提得到的SOD酶活力為2865.22U/mL。

2.2 SOD粗提磷酸緩沖液提取法 磷酸緩沖液提取法中，測(cè)定磷酸緩沖液的pH分別為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0，粗提時(shí)間為1～5min，測(cè)定粗提得到的SOD的光吸收值。由圖2可知，當(dāng)所用磷酸緩沖液pH為7.8時(shí)OD325值最小，為0.016，通過(guò)計(jì)算得到SOD酶活力為2274.81U/mL。對(duì)比熱變性法粗提得到SOD酶活力數(shù)值可知，熱變性法為最佳選擇，最佳變性溫度為60℃。

2.3 SOD粗提物的純化 采用硫酸銨分級(jí)鹽析法對(duì)經(jīng)60℃條件下熱變性獲得的大蒜SOD粗提液進(jìn)行純化，純化后得到的SOD酶液進(jìn)一步透析脫鹽。最終測(cè)定提純得到的SOD酶液抑制速率為0.003/min（A325nm）。通過(guò)計(jì)算可知，經(jīng)純化后的大蒜SOD酶活力為3790.53U/mL。

2.4 酶的類(lèi)型 由圖3可知，該酶只對(duì)H2O2敏感，對(duì)氯仿-乙醇不敏感。因此可初步確定該酶是Cu/Zn-SOD，即大蒜SOD屬于Cu/Zn-SOD。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：熱變性法提取大蒜SOD最合適的變性溫度為60℃，磷酸緩沖液提取法提取大蒜SOD最合適的緩沖液pH值為7.8，且熱變性法提取的大蒜SOD酶活力大于磷酸緩沖液提取法提取的大蒜SOD酶活力。因此，熱變性法（60℃）是提取大蒜SOD最適合的方法。大蒜SOD粗提液經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析法純化，然后進(jìn)一步透析脫鹽，得到的SOD酶液的酶活力明顯高于SOD粗提液的酶活力。因此硫酸銨分級(jí)鹽析法配合透析脫鹽為較理想的SOD純化方法，SOD酶活力可達(dá)3790.53U/mL。通過(guò)對(duì)大蒜SOD的酶類(lèi)型進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該酶只對(duì)H2O2敏感，對(duì)氯仿-乙醇不敏感。因此，可判定大蒜SOD為Cu/Zn-SOD。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：徐世紅）