王建兵，韓麗喬，林海標(biāo)，張喬軒，嚴(yán) 君，莊俊華，黃憲章

（廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東 廣州 510120）

血清、尿液α-淀粉酶測量是臨床上最常用的實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)之一，在胰腺疾病，特別是急性胰腺炎的診斷、療效觀察中具有重要作用。淀粉酶是急性胰腺炎早期診斷指標(biāo)[1]，為解決臨床檢驗(yàn)血清淀粉酶測量結(jié)果的正確性，實(shí)現(xiàn)測量結(jié)果的可溯源性和臨床檢驗(yàn)結(jié)果可比、互認(rèn)，減少重復(fù)檢查，減輕患者負(fù)擔(dān)，本實(shí)驗(yàn)室制備了2個水平的冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

cobas 8000全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，U-3310分光光度計(jì)（日本日立公司）。參考方法試劑：N-2-羥基乙基哌嗪-N'-乙基磺酸（批號為017K5410，美國Sigma公司），4，6-亞乙基-4-硝基苯-α-（1-＞4）-D-麥芽七糖（批號為121214A，北京阿匹斯公司）。有證參考物質(zhì)IRMM/IFCC-456（歐盟參考物質(zhì)和測量研究中心）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣本制備

選擇外觀清亮，無脂血、黃疸和溶血的樣本。乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋體抗體、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體檢測陰性。經(jīng)2次除菌過濾后，分裝至無菌收集管中，每支1 mL，共300支。制備了2個水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可-70 ℃冰箱保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評價(jià)

按照J(rèn)JF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》和JJF 1644—2017《臨床酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制》要求進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性、互換性評價(jià)[2-3]，所有樣本均采用cobas 8000全自動生化分析儀測量。

1.3.1 均勻性檢驗(yàn) 取15支樣本，在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行評價(jià)。方差分析結(jié)果中的組間方差MSamong＞組內(nèi)方差MSwithin時，樣本間均勻性的標(biāo)準(zhǔn)偏差sbb計(jì)算公式為：

式中ubb，rel為α-淀粉酶由于樣本不均勻性引入的不確定度分量。

1.3.2 穩(wěn)定性評價(jià) 采用同步穩(wěn)定性進(jìn)行評估，結(jié)果采用回歸分析的t檢驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)，基本模型為：Y=β0+β1X，式中β1、β0為回歸系數(shù)，X為時間，Y為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值。（1）短期穩(wěn)定性評價(jià)。評價(jià)運(yùn)輸對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)待定特性值的影響。分別于第1、2、3天從冰箱中取出樣本，放入干冰冷凍包裝箱，與第5天從儲存冰箱中取出的樣本同時進(jìn)行測量。每個水平1個監(jiān)測點(diǎn)抽取2支樣本，4個監(jiān)測點(diǎn)合計(jì)8支樣本。在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。（2）長期穩(wěn)定性評價(jià)。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-70 ℃保存1年的穩(wěn)定性。分別于第0、7、31、90、182天從-70 ℃冰箱中取出樣本，放入液氮瓶中，與第365天從-70 ℃冰箱中取出的樣本同時進(jìn)行測量。每個水平1個監(jiān)測點(diǎn)抽取3支樣本，共6個監(jiān)測點(diǎn)，合計(jì)18支樣本，在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。（3）使用時穩(wěn)定性評價(jià)。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用時儲存于冰箱（2～8 ℃）或室溫（20～25 ℃）的穩(wěn)定性。分別于24、6、4、2 h從-70 ℃冰箱中取出4支樣本，冰箱或室溫各放置2支，與測量前從-70 ℃冰箱中取出的樣本同時進(jìn)行測量。每個水平1個監(jiān)測點(diǎn)抽取4支樣本，冰箱或室溫環(huán)境各放置2支，進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，共5個監(jiān)測點(diǎn)，合計(jì)20支樣本。在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。（4）穩(wěn)定性引入的不確定度。由穩(wěn)定性引入的不確定度計(jì)算公式為：us=s（β1）×X，式中us為由穩(wěn)定性引入的不確定度，s（β1）為β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差，X為給定的保存期限。

1.3.3 互換性評價(jià) 互換性采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。（1）參比檢測系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室參照2006年國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會推薦的α-淀粉酶參考測量程序（37 ℃）[4]建立一級參考方法[5]。（2）臨床評價(jià)檢測系統(tǒng)。系統(tǒng)1：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀及配套試劑（AMY384295）、校準(zhǔn)品（cfas，lot：305596）和測量程序；系統(tǒng)2：美國貝克曼庫爾特公司AU5800全自動生化分析儀及配套試劑（AMY6159）、校準(zhǔn)品（lot：F6662）和測量程序；系統(tǒng)3：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司試劑（AMY 142819001）、校準(zhǔn)品（059318006）和測量程序；系統(tǒng)4：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、四川邁克生物股份有限公司試劑（AMY0518061）、校準(zhǔn)品（Lot：366059）和測量程序。（3）樣本。共20份新鮮單供體人血清樣本，濃度范圍覆蓋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度范圍，每個樣本重復(fù)測量2次。

1.4 定值

1.4.1 定值方法 定值依據(jù)參考文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行（同參比檢測系統(tǒng)）。2個水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每日分別測量3次，連續(xù)測量3 d，共9個測量結(jié)果。

1.4.2 定值方式 由6家通過中國合格評定國家認(rèn)可委員會認(rèn)可的參考（校準(zhǔn)）實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值。

1.4.3 定值及其引入的不確定度計(jì)算 根據(jù)測定數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布狀態(tài)，組間數(shù)據(jù)是否為等精度進(jìn)行計(jì)算[2]。

1.4.4 結(jié)果檢驗(yàn) 采用Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，采用格拉布斯（Grubbs）法進(jìn)行組內(nèi)可疑值檢驗(yàn)和各組數(shù)據(jù)平均值顯著性檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)等精度檢驗(yàn)采用科克倫（Cochran）法。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評定 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uCRM）計(jì)算公式為：

式中ubb為由甁間不均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，ults為由長期（1年）不穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，usts為由短期不穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，uchar為由定值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。擴(kuò)展不確定度（UCRM）按照公式：UCRM=合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uCRM）×κ計(jì)算，式中κ為包含因子，此處κ=2（置信水平為95%）。

2 結(jié)果

2.1 均勻性單因素方差分析

根據(jù)自由度（14，30）及設(shè)定的顯著性水平（α=0.05），通過F值分布臨界值表查到臨界Fα=2.04，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的F值分別為1.232（水平1）、1.656（水平2），F(xiàn)＜Fα，顯示標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有良好的均勻性。見表1。

表1 α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性單因素方差分析結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性評價(jià)結(jié)果

均值與時間關(guān)系的直線回歸方程為直線斜率|β1|＜t0.95，n-2·s（b1），式中n-2為自由度，P=0.95，s（b1）為直線斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差，斜率不顯著，未觀測到不穩(wěn)定性，表明在規(guī)定的時間內(nèi)均穩(wěn)定。見表2。

表2 穩(wěn)定性評價(jià)結(jié)果

2.3 互換性評價(jià)結(jié)果

各系統(tǒng)回歸方程的r2＞0.009 5，測量結(jié)果位于95%可信區(qū)間上、下限內(nèi)。見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)互換性評價(jià)結(jié)果

2.4 定值結(jié)果和不確定度

采用格拉布斯（Grubbs）法進(jìn)行組內(nèi)可疑值檢驗(yàn)和各組數(shù)據(jù)平均值顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示組內(nèi)無可疑值。各實(shí)驗(yàn)室平均值之間無顯著性差異，等精度檢驗(yàn)的臨界值為0.422 9。其他結(jié)果見表4。

表4 α-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果和擴(kuò)展不確定度

3 討論

利用冰凍混合人血清研制酶學(xué)二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，甚至一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，原料無基質(zhì)效應(yīng)，均勻性良好，穩(wěn)定性可靠，但不易購買到。為解決我國同類產(chǎn)品供應(yīng)不足的問題，本實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合其他5家參考實(shí)驗(yàn)室，采用聯(lián)合定值的方法，研制了2個水平的α-淀粉酶冰凍混合人血清候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。聯(lián)合定值實(shí)驗(yàn)室均通過了中國合格評定國家認(rèn)可委員會依據(jù)ISO/IEC 17025和ISO 15195標(biāo)準(zhǔn)的認(rèn)可，定值使用的方法為國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會推薦的一級參考方法[4]，所得結(jié)果直接溯源到國際單位，解決了我國商品化試劑盒校準(zhǔn)品長期缺乏溯源性的問題。通過聯(lián)合定值，避免了單個實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的偏移，定值結(jié)果更可靠。

穩(wěn)定性評估采用同步穩(wěn)定性評估，將所有樣本保存在液氮條件下，在同一時間使用同一檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，避免了檢測系統(tǒng)不同時間、不同批號試劑或校準(zhǔn)品，甚至儀器不同狀態(tài)引起的偏移。在測量過程中，測量樣本較多，且放置于開口樣本杯中，應(yīng)縮短測量批之間的時間，否則測量結(jié)果變異較大。本研究研制的2個水平α-淀粉酶冰凍混合人血清候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性良好，可至少穩(wěn)定1年，但與美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)909c相比，穩(wěn)定期仍然較短。本實(shí)驗(yàn)室將繼續(xù)監(jiān)測，以分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的更長期限。

本研究采用科克倫（Cochran）法檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的等精度。選取的顯著性水平α不同，其判斷標(biāo)準(zhǔn)也不同。若最大方差與所有實(shí)驗(yàn)室方差和之比＜α=0.05的科克倫（Cochran）檢驗(yàn)臨界值C，表明各實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)平均值為等精度；若＞α=0.05、＜α=0.01的科克倫（Cochran）檢驗(yàn)臨界值C，表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被檢驗(yàn)的最大方差組為歧離值，與各實(shí)驗(yàn)室核實(shí)并確認(rèn)測量方法、測量條件及操作過程均無誤后，仍按等精度處理；若＞α=0.01的科克倫（Cochran）檢驗(yàn)臨界值C在經(jīng)確認(rèn)測量方法、測量條件及操作過程均無誤后，應(yīng)慎重采用不等精度加權(quán)方式處理。

本實(shí)驗(yàn)室研制的冰凍混合人血清α-淀粉酶候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性好，穩(wěn)定性符合預(yù)期，具有可溯源性和互換性，對推動酶學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程意義重大。

（致謝：感謝上海市臨床檢驗(yàn)中心居漪，四川邁克生物科技股份有限公司孫可其，美康生物科技股份有限公司沈敏，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司王英國，北京利德曼生化股份有限公司劉春龍?jiān)跇?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程中給與的幫助。）