王磊，高宗露，宗麗娜，魯茂林，王文瓊，陳大衛(wèi)，顧瑞霞

（揚州大學江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225127）

乳酸菌是一類發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱，是人和動物體內(nèi)具有特殊生理功能的有益菌群，具有調(diào)節(jié)人體免疫、抑制有害菌增殖、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等功能[1]。德氏乳菌保加利亞亞種又稱為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus，L.bulgaricus），具有抗癌抗腫瘤、提高機體免疫力、促進胃腸道蠕動等益生功能[2]。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，S.thermophilus）在酸奶發(fā)酵前期產(chǎn)酸、產(chǎn)多糖等方面發(fā)揮著重要作用，產(chǎn)酸能力強的嗜熱鏈球菌有助于酸奶產(chǎn)品快速發(fā)酵凝乳、縮短發(fā)酵時間、提高生產(chǎn)效率、降低酸奶生產(chǎn)成本[3-5]。乳酸菌和食品生產(chǎn)密切相關(guān)，長期以來，乳酸菌作為益生菌被廣泛應用于食品尤其是乳制品行業(yè)中，其中嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種是目前制作酸乳最主要的菌種[6-7]。

乳酸菌的食用歷史長達數(shù)千年，是世界公認的“一般公認安全（generally recognized as safe，GRAS）”的微生物[7]。在現(xiàn)代醫(yī)學中，抗生素是防御細菌感染的主要手段。但近年來，由于抗生素的不正當使用（過度使用和誤用），許多乳酸菌產(chǎn)生了耐藥性，乳酸菌應用所帶來的安全性問題已經(jīng)引起人們的關(guān)注[8-9]。研究表明耐藥性的傳播主要發(fā)生在臨床相關(guān)的菌株中，但已有體內(nèi)試驗證明，在腸道益生菌之間、腸道益生菌與致病菌之間也存在耐藥基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[10]。部分乳酸菌對臨床常用藥物產(chǎn)生耐藥性，還可能將其攜帶的耐藥基因通過食物鏈傳遞給其它腸道及呼吸道致病菌，并賦予其耐藥性[11]。四環(huán)素類、磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、氯霉素類等抗生素由于其價格低廉，且有廣譜性和低毒性等特點[12]，被廣泛應用于畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，但由于其本身的副作用，在動物組織中的殘留，就可能給人類帶來很大的危害[13-14]。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）確定抗生素耐藥性已經(jīng)成為21世紀主要的健康性問題之一[15]。早期對細菌耐藥性的研究主要集中在病原微生物上[16-17]，而近年來乳酸菌耐藥性的研究逐步成為人們關(guān)注的焦點。

目前，我國酸乳發(fā)酵劑90%以上來自于國外生產(chǎn)，并且這些酸乳發(fā)酵劑并未提供相關(guān)的耐藥性情況[18-20]。因此，研究乳酸菌抗生素耐藥性并評估其安全性對食品安全具有重要意義，本研究將酸乳發(fā)酵劑中的乳酸菌進行分離鑒定，并對分離菌株進行抗生素耐藥性的研究，以期為酸乳發(fā)酵劑中乳酸菌的安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

48份酸乳發(fā)酵劑樣品：市售；Premix TaqTM、溶菌酶（≥20 000 U/mg）、細菌基因組DNA提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 藥敏紙片

12 種抗生素藥敏試紙[青霉素（penicillin，P）、頭孢唑啉（cefazolin Sodium，CS）、頭孢唑啉先鋒（cephazolin，KZ）、氯霉素（chloramphenicol，C）、萬古霉素（vancomycin，VA）、四環(huán)素（tetracycline T）、復方新諾明（sulfamethoxazole，CO SMZ）、氨芐西林（ampicillin，AMP）、克拉霉素（clarithromycin，CLA）、鏈霉素（streptomycin，SM）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、利福平（rifampicin，RD）]：杭州天和微生物試劑有限公司，劑量符合美國臨床實驗室標準化研究所（Clinicaland Laboratory Standards Institute，CLSI/NCCLS）2017 版 的規(guī)定。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機：德國EPPEENDORF公司；Olympus CX41熒光顯微鏡：日本Olympus公司；SPX-150FS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Infinity 3026凝膠成像系統(tǒng)：法國Vilber Lourmat公司；Millipore Direct 8超純水儀：美國Milliport公司；HE-120水平電泳槽：上海天能儀器設(shè)備有限公司；JF-SX-500全自動滅菌鍋：日本TOMY公司；ZHJH-C1209B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；VERITI96聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國 ABI公司。.

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與純化

將發(fā)酵劑樣品置于無菌超凈工作臺中，挑取適量樣品，分別接種于MRS液體培養(yǎng)基和M17液體培養(yǎng)基中擴培24 h，在MRS和M17固體培養(yǎng)基上進行平板劃線，培養(yǎng)48 h后，觀察菌落特征，挑取單菌活化，二次劃線，挑取單菌落，直至菌落形態(tài)均一致。進行革蘭氏染色，觀察菌體的形態(tài)。在MRS和M17液體培養(yǎng)基（含70%甘油）中于-80℃冰箱中保存。

1.3.2 乳酸菌基因組DNA的提取

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明方法操作提取分離菌株的基因組。

1.3.3 擴增乳酸菌16S rDNA基因序列

擴增的反應體系（50.00 μL）：10 × buffer 5.00 μL、Mg2+3.00 μL、2.50 mol/L 脫氧核糖核苷三磷酸 4.00 μL、10.00 pmol引物 P1 和 P2 各 1.50 μL、Taq 酶 1.50 μL、模板 DNA 5.00 μL，以雙蒸水補至 50.00 μL。

PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性3min；95℃變性15s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸5 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物檢測與測序

取PCR產(chǎn)物5.00 μL，用1.00%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：120V，30min。電泳結(jié)束后用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色15min，凝膠成像儀拍照觀察，在1 500 bp處有清晰條帶的樣品送至上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序，將測序結(jié)果提交到BLAST進行在線比對得出結(jié)果。

1.3.5 抗生素耐藥性敏感試驗

表1為抗生素耐藥性的判斷標準。

表1 抗生素耐藥性的判斷標準Table 1 Criteria for judging antibiotic resistance

利用紙片擴散法對分離的乳酸菌進行青霉素、頭孢唑啉、頭孢唑啉（先鋒）、氯霉素、萬古霉素、四環(huán)素、復方新諾明、氨芐西林、克拉霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星和利福平12種抗生素的耐藥性敏感試驗。將待測菌株活化二代，將菌液8 000 r/min，4℃，離心5 min，并以無菌水調(diào)整菌液濃度至OD600=0.5，取菌液200 μL涂布，待培養(yǎng)基上的菌液略干后，以無菌操作取出藥敏紙片，貼于接好同種乳酸菌誘導的LB固體平板內(nèi)，各紙片中心相距大于24 mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15 mm，每皿貼3個紙片，每菌株重復試驗3次，同時設(shè)空白藥敏紙片為對照。室溫（25℃）放置0.5 h，然后置于37℃/43℃培養(yǎng)，24 h后測量并記錄抑菌圈直徑。根據(jù)美國臨床和實驗室標準化研究所制定的《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》（2017年版）評價試驗乳酸菌對抗生素的耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定結(jié)果

圖1為部分乳酸菌16S rDNA區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。

圖1 部分乳酸菌16S rDNA區(qū)域的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products in 16S rDNA region of some Lactobacillus

從48份酸乳發(fā)酵劑中共分離出202株乳酸菌，將其16S rDNA擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，電泳條帶約在1 500 bp處，擴增條帶清晰，無明顯的拖尾、彌散現(xiàn)象，說明16S rDNA擴增成功。

表2為乳酸菌的16S rDNA基因序列同源性比對結(jié)果。

表2 乳酸菌的16S rRNA基因序列同源性比對結(jié)果Table 2 16S rRNA gene sequence homology comparison results of lactic acid bacteria

將測序拼接完成的16S rDNA基因序列使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序進行同源性比對。結(jié)果表明：202株單菌株測序準確度均大于99%，排除139株重復菌株，剩余63株乳酸菌，其中43株為嗜熱鏈球菌，20株為德氏乳桿菌保加利亞亞種。

2.2 嗜熱鏈球菌抗生素耐藥性比較

表3為不同嗜熱鏈球菌抗生素耐藥性結(jié)果。

表3 不同嗜熱鏈球菌抗生素耐藥性結(jié)果Table 3 Drug sensitivity results of different Streptococcus thermophiles

不同抗生素對不同來源的嗜熱鏈球菌的影響不同，43株嗜熱鏈球菌普遍對頭孢唑啉、頭孢唑啉先鋒、氯霉素、萬古霉素敏感，其中有17株菌株對12種抗生素均無耐藥性。有5株菌株對12種抗生素均敏感。43株嗜熱鏈球菌對青霉素、氨芐西林、四環(huán)素，鏈霉素耐藥性較高，其中菌株HST-2和菌株HST-5-1對6種抗生素敏感。

2.3 德氏乳桿菌保加利亞亞種抗生素耐藥性比較

表4為不同德氏乳桿菌保加利亞亞種的抗生素耐藥性結(jié)果。

表4 不同德氏乳桿菌保加利亞亞種抗生素耐藥性結(jié)果Table 4 Drug sensitivity results of different Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus

德氏乳桿菌保加利亞亞種對12種抗生素的耐藥性要高于嗜熱鏈球菌，20株德氏乳桿菌保加利亞亞種對頭孢唑啉、頭孢唑啉先鋒、氯霉素、克拉霉素和利福平普遍敏感，對青霉素、復方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星耐藥性較高，其中菌株HDB-7對8種抗生素耐藥。研究表明德氏乳桿菌保加利亞亞種對大多數(shù)核酸抑制劑，如環(huán)丙沙星、利福平、復方新諾明等以及氨基糖苷類抗生素，如鏈霉素、萬古霉素等通常具有耐藥性[21]，對糖肽類抗生素萬古霉素為固有耐藥性[22]。但也有研究者認為這并不代表是物種的固有特性，可能存在可變性[23]。20株德氏乳桿菌保加利亞亞種對萬古霉素普遍敏感，此結(jié)果也充分證明了德氏乳桿菌保加利亞亞亞種對萬古霉素并非是固有耐藥性。于濤等[24]從25份酸奶樣品中分離得到56株乳酸菌對其耐藥性進行研究，結(jié)果顯示，這些菌株對鏈霉素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥率較高，且在相同藥物，相同濃度，相同代次的情況下，嗜熱鏈球菌對3種抗生素的耐藥性明顯低于保加利亞乳桿菌；同時周寧等[25]也發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌對3種抗生素的敏感性明顯高于德氏乳桿菌保加利亞亞種，其形成原因還有待進一步研究。

2.4 乳酸菌對不同抗生素的耐藥率

表5為乳酸菌對不同抗生素的耐藥率結(jié)果。

表5 乳酸菌對12種抗生素的耐藥率Table 5 Resistance rates of different lactic acid bacteria to 12 antibiotics

63株乳酸菌對青霉素（36.51%）、復方新諾明（33.33%）、鏈霉素（28.57%）、氨芐西林（26.98%）、環(huán)丙沙星（20.63%）表現(xiàn)出不同程度的耐藥率，而對其它抗生素耐藥率則比較低。其中43株嗜熱鏈球菌對青霉素耐藥率最高，達到了30.23%，其次為氨芐西林（25.58%）、四環(huán)素（20.93%），鏈霉素（18.60%），利福平（16.28%）和復方新諾明（13.95%），對其它抗生素耐藥率則相對低；20株德氏乳桿菌保加利亞亞種對復方新諾明耐藥率最高，達到了75%，其次為環(huán)丙沙星、青霉素、鏈霉素、氨芐西林及萬古霉素分別為60%、50%、50%、30%和30%，對克拉霉素和利福平表現(xiàn)為敏感或中介耐藥，對其它抗生素耐藥率則比較低。所測菌株對抗生素的耐藥情況為青霉素>復方新諾明>鏈霉素>氨芐西林>環(huán)丙沙星>四環(huán)素>利福平>萬古霉素>頭孢唑啉>頭孢唑啉先鋒>氯霉素>克拉霉素。

2.5 不同乳酸菌的多重耐藥率

表6為不同乳酸菌的多重耐藥率的結(jié)果。

表6 不同乳酸菌的多重耐藥率Table 6 Multiple drug resistance rates of different lactic acid bacteria%

63株乳酸菌中有33株存在多重耐藥性，多重耐藥性為52.38%，其中嗜熱鏈球菌對12種抗生素的耐藥性低于德氏乳桿菌保加利亞亞種，嗜熱鏈球菌30.23%的菌株具有多重耐藥性，而德氏乳桿菌保加利亞亞種的具有多重耐藥性菌株達到了100%；有23種菌株對3種抗生素耐藥，有14株菌株對4種抗生素耐藥，有7株菌株對超過5種抗生素耐藥。本次試驗結(jié)果與之前相關(guān)學者報道較一致[10，26]。受試菌嚴重的多重耐藥性可能是由于其本身所固有的特性，也可能是因為在生產(chǎn)加工過程中菌株發(fā)生變異造成的[25，27]。

3 結(jié)論

本研究采用分離自酸乳發(fā)酵劑的63株乳酸菌作為供試菌株，測試它們對12種臨床常用抗生素的耐藥性，結(jié)果表明：酸乳發(fā)酵劑中的乳酸菌存在一定的耐藥性問題，63株乳酸菌對青霉素、復方新諾明、氨芐西林、鏈霉素、和環(huán)丙沙星耐藥性較高，對頭孢唑啉、氯霉素、萬古霉素、四環(huán)素等均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，63株乳酸菌中嗜熱鏈球菌對12種抗生素的耐藥性顯著低于德氏乳桿菌保加利亞亞種。因此，應當制定和完善乳酸菌抗生素耐藥性的相關(guān)檢測標準，加強對原料乳中抗生素殘留的檢測及乳酸菌耐藥基因檢測；同時在乳酸菌被應用于食品和奶制品生產(chǎn)時，應首先避免選用具有耐藥性的菌株，以減少發(fā)酵乳制品中抗生素殘留及乳酸菌耐藥問題的出現(xiàn)，避免乳酸菌在實際生產(chǎn)中帶來安全隱患。