徐 旭, 劉金玲, 梁國(guó)威

(航天中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100049)

近年來，我國(guó)人民生活水平有很大幅度的提高，但肥胖、高血壓、血脂紊亂及糖代謝異常等疾病發(fā)生率也逐年的增高，并且多種異常的臨床代謝癥狀同時(shí)出現(xiàn)稱為代謝綜合征(Metabolic syndrome,MS)，可引起血管動(dòng)脈粥樣硬化形成斑塊，進(jìn)而導(dǎo)致心梗、腦梗及糖尿病。近期發(fā)生的影響全球的新型冠狀病毒，對(duì)人類的健康和生存存在嚴(yán)重威脅。有研究顯示，新冠重癥患者體型偏胖，合并癥中存在高血壓、糖尿病是發(fā)展成重型、危重型的高危因素之一。遺傳因素對(duì)肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥的影響是近年來研究的熱點(diǎn)之一，其最終導(dǎo)致MS發(fā)病。Fall等[1]文獻(xiàn)綜述中研究的肥胖相關(guān)基因有57種，其中絲裂原活化蛋白激酶激酶5(Mitogen-activated protein kinase kinase 5,MAP2K5)-rs4776970的基因位點(diǎn)國(guó)內(nèi)研究較少，我們通過此隊(duì)列研究，探索MAP2K5基因與代謝異常及血管慢性炎癥的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料:采集我院1224例健康體檢人群，根據(jù)NCEP-ATPⅢ的中國(guó)人修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)將他們分為代謝綜合征(MS)組和非MS組，其中MS組520例；非MS組704例。排除嚴(yán)重感染、腫瘤、血液病、肝病等。測(cè)量腰圍(WC)、體重指數(shù)(body mass index,BMI)；收集高血壓史、吸煙史、糖尿病史及其藥物治療情況、空腹血糖等危險(xiǎn)因素。MS診斷：①男性腰圍≥90cm，女性腰圍≥80cm；②TG≥1.70mmoL/L；③HDL-C<1.29 mmoL/L(女)，HDL-C<1.03 mmoL/L(男)。血壓≥130/85mmHg和降壓藥物治療者；⑤FPG≥5.6mmoL/L和降糖藥物治療者。符合以上3項(xiàng)及以上。

1.2方 法

1.2.1實(shí)驗(yàn)室檢查：使用真空采血管抽取空腹肘靜脈血，4h內(nèi)檢測(cè)完畢。采用貝克曼庫爾特公司AU5811全自動(dòng)生化分析儀，測(cè)定甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)，日本積水株式會(huì)社提供LDL、HDL、hs-CRP試劑及校準(zhǔn)品，AUTEC DIAGNOSTICA公司提供TGCHO試劑及校準(zhǔn)品。利德曼公司提供血糖試劑及校準(zhǔn)品檢測(cè)空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，采用日本東曹公司提供的糖化血紅蛋白儀HLC-723G8及試劑、質(zhì)控、校準(zhǔn)品測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1C)。

1.2.2DNA提?。篍DTA-K2抗凝血2mL，按照TIANGEN公司提供的DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行DNA的提取，-80℃冰箱備用。

1.2.3SNP檢測(cè)：MAP2K5-rs4776970等位基因采用特異性引物(ARMS原理)，通過特異引物與TaqMan探針和公用引物建立的2個(gè)反應(yīng)體系的Ct值測(cè)定不同等位基因，根據(jù)ΔCt(ΔCt=野生引物反應(yīng)體系Ct值-A突變引物反應(yīng)體系Ct值)來判定基因型。各序列見表1。

表1 ARMS-雙TaqMan方法檢測(cè)肥胖相關(guān)基因位點(diǎn)突變引物及探針序列

PCR分型反應(yīng)體系為天根生化科技(北京)有限公司提供，20ul，DNA 2ul，2× Master mix 8ul和Ehance inhibit1ul，MAP2K5-rs4776970上、下游引物各1ul(終濃度0.25uM)，探針各1ul(0.25uM)，水3ul。95℃2min，95℃15s、60℃1min(共40個(gè)循環(huán))作為反應(yīng)條件。使用美國(guó)ABI公司的7500熒光定量PCR儀。任意選取分型后的MAP2K5-rs4776970不同等位基因型各3例，經(jīng)北京諾賽基因組研究中心測(cè)序證實(shí)100%符合。

1.3統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。兩組間計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)?；蚍中团cMS間的獨(dú)立相關(guān)性用Logistic回歸分析。三組間比較使用ANOAN方差分析,以P<0.05認(rèn)為其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組基線資料比較:MS組合非MS組人群的基本資料見表2，除了WC、舒張壓、收縮壓、TG、HDL-C、FPG這些納入分組標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)有差異外，MS組年齡、HbA1c、Hs-CRP水平顯著高于非MS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；TC、LDL-C水平MS組與非MS組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 1224例研究對(duì)象基礎(chǔ)資料

2.2MAP2K5-rs4776970基因型在MS中頻率分布:1224例研究對(duì)象中MAP2K5-rs4776970等位基因分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.073，P=0.787)，具有群體代表性。MS組中MAP2K5-rs4776970的AA型(7.5% vs 4.0%)分布頻率顯著升高(P<0.05),TT型(56.2%vs 59.5%)、TA型(36.3% vs 36.5%)的分布頻率兩組間無明顯差別(P=0.954)，A等位基因頻率在MS組中的發(fā)生率顯著高于非MS組(25.7% vs. 22.2%，P=0.048)見表3。

表3 MAP2K2-rs4776970基因型在MS中分布頻率n(%)

2.3MAP2K5-rs4776970基因型發(fā)生MS的危險(xiǎn)性：對(duì)年齡和性別校正后，Logistic回歸分析表明，MAP2K5-rs4776970基因型與MS患病無顯著相關(guān)性(OR值為0.851，95%CI：0.7-1.035，P=0.106)。

2.4MAP2K5-rs4776970各基因型臨床資料比較：MAP2K5-rs4776970三個(gè)基因型與WC、BMI及Hs-CRP相關(guān)(P=0.015；P=0.011；P=0.049)，進(jìn)行任意兩組的比較,結(jié)果提示AA型的BMI、WC與TT型比較有顯著差異(P<0.01)；與TT型比較AA型的Hs-CRP及TA型的WC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 MAP2K2-rs4776970基因型之間臨床資料比較

3 討 論

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)中重要的信號(hào)系統(tǒng)。其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中三種激酶(MAP3K、MAK2K、MAPK)通過磷酸化依次激活，影響基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、分化和凋亡、參與炎癥應(yīng)激反應(yīng)等重要病理生理過程。MAP2K中的MAP2K5是激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶(ERK)5的重要激酶，對(duì)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控有重要作用，可以介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)于細(xì)胞生存、增殖分化起著極其重要的作用。MAK2K5與肥胖、BMI、IR、瘦素等密切相關(guān)[2,3]。MAP2K5-rs4776970位于15q23，它參與激活的大MAPK通路(BMKI)在動(dòng)脈粥樣硬化引起的心血管疾病中作用重要，可維持血管生成、完整性及心臟發(fā)展，使心室肥厚，增加心臟功能，還與細(xì)胞外及神經(jīng)生長(zhǎng)因子的作用相關(guān)[4]。

本研究顯示，年齡、HbA1c、hs-CRP水平MS組顯著高于非MS組，它們之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示該基因位點(diǎn)與糖代謝、肥胖及血管炎癥密切相關(guān)。其中AA型(7.5%vs 4.0%)分布頻率顯著升高(P<0.05)，A等位基因與MS相關(guān)(P=0.048)，是MS的遺傳危險(xiǎn)因素。這可能與MAP2K5激活BMKI通路參與下丘腦瘦素-黑皮質(zhì)素體重調(diào)控有關(guān)，瘦素通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)能量代謝引起肥胖，肥胖是導(dǎo)致MS的發(fā)病的重要因素。付俊玲等[5]的一篇關(guān)于3506名中國(guó)兒童的研究顯示該基因位點(diǎn)與兒童肥胖也顯著相關(guān)(P=0.004)，特別是BMI、WC與血壓(P=0.02;P=0.02;P=0.03)，與瘦素、脂肪量呈正相關(guān)(P=0.013；P=0.014)，介導(dǎo)肥胖的原理可能是通過中樞神經(jīng)的“瘦素抵抗”，激活ERK通路，對(duì)胰島素信號(hào)通路發(fā)揮了負(fù)調(diào)控作用。內(nèi)臟脂肪較易分解成游離的脂肪酸，沉積后導(dǎo)致機(jī)體糖代謝障礙，也可通過釋放出炎性因子及引起胰島素抵抗來參與MS發(fā)病，同時(shí)慢性炎癥也增加了血糖控制不良的T2D患者發(fā)生心肌梗死和感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在控制了性別年齡后，MAP2K5-rs4776970與MS無顯著相關(guān)(P=0.106)，說明該基因型與MS的關(guān)系可能與年齡增長(zhǎng)有關(guān)。

hs-CRP是一個(gè)炎性指標(biāo)，排除急性炎癥情況，可用來間接反映血管的慢性炎癥程度，對(duì)評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化程度，有效預(yù)測(cè)心腦血管疾病敏感性高。本研究中MS組與非MS組的hs-CRP水平差異顯著，提示MS人群存在血管慢性炎癥，且攜帶AA基因型的人群hs-CRP水平明顯高于攜帶TT型的人群，更易發(fā)生血管炎癥。MAP2K5參與調(diào)控了多種致炎因子誘導(dǎo)的細(xì)胞間黏附分子、血管細(xì)胞黏附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶和單核細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂，在早期的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中起到關(guān)鍵作用[6]。炎性反應(yīng)是MS的誘發(fā)因素，通過多種機(jī)制參與其發(fā)生、發(fā)展。

綜上，本研究提示，MAP2K5-rs4776970基因多態(tài)性與肥胖、糖代謝異常及血管慢性炎癥相關(guān)，MAP2K5-rs4776970AA基因型及A等位基因頻率在MS人群中比例更高，但其不是MS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究還缺乏大樣本前瞻性研究，以明確MAP2K5- rs4776970位點(diǎn)基因多態(tài)性與異常代謝及血管慢性炎癥的相關(guān)性。減少肥胖，降低MS的發(fā)生，可能是降低新型冠狀病毒感染重癥率和死亡率的有效方法。