黃 赫，管仲瑩，趙 磊

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，遼寧 沈陽 110034)

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，近年來人們的飲食發(fā)生了很大的變化，脂肪食品占日常飲食的很大一部分。 持續(xù)的高脂飲食會導(dǎo)致體內(nèi)的脂質(zhì)代謝紊亂，主要表現(xiàn)為高水平的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高膽固醇血癥和低水平的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)[1]。 糖脂代謝紊亂與糖代謝紊亂和脂代謝紊亂相聯(lián)系，可誘發(fā)肥胖、2型糖尿病(T2DM)、高血壓、血脂異常、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化等。除此以外，脂蛋白水平將受到干擾或合并脂質(zhì)代謝紊亂，同時HDL-C水平降低，總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C水平升高。最后，過度脂肪堆積引起肥胖并導(dǎo)致高脂血癥。高脂血癥被歸類為導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的主要危險因素之一。越來越多的證據(jù)表明，高脂血癥是心血管疾病的主要原因，與冠心病、中風(fēng)、高血壓、肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病等疾病密切相關(guān)[2]。脂質(zhì)代謝紊亂是動脈粥樣硬化的病變基礎(chǔ)，而主動脈粥樣硬化常無特異性癥狀。本研究采用去卵巢手術(shù)模擬絕經(jīng)期，探討絕經(jīng)期對高脂血癥大鼠主動脈脂代謝的可能影響，進(jìn)而闡明絕經(jīng)期高脂血癥影響主動脈血管脂質(zhì)代謝的精細(xì)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗材料:30只健康雌性SD大鼠(200±20)g購買于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號為SCXK(遼)2015-0001。RNA提取試劑RE-03012購自FOREGENE公司，ABclonal 2×快速熒光定量qRCR反應(yīng)預(yù)混液(低Rox)RK21202購自ABclonal公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A購自寶生物工程(大連)有限公司，大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C ELISA 試劑盒(批號201912)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。德國Thermo公司Multiskan FC酶標(biāo)儀，ABI7500實(shí)時定量PCR儀。

1.2方 法

1.2.1動物模型的建立:30只健康SD雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為空白組、模型1組、模型2組。模型2組大鼠去除雙側(cè)卵巢，術(shù)后腹腔注射青霉素3d以防感染，陰道分泌物圖片確定未出現(xiàn)后造模：模型1組和模型2組大鼠每天給予高脂飼料(3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油)連續(xù)8周，造模第7天、14天分別給予維生素D3(50萬IU/kg、30萬IU/kg)灌胃，第7周給予異丙腎上腺素(ISO)5mg/kg多點(diǎn)皮下注射，連續(xù)1周[3]。

1.2.2標(biāo)本采集:空白組、模型1組、模型2組每日1次灌服同等容積蒸餾水。各組給藥8周后分離心臟主動脈，液氮速凍后保存在-80℃冰箱。

1.2.3試劑盒提取大鼠主動脈血管mRNA:取心臟主動脈組織20mg 加入500μL Buffer RL1，電動勻漿器將組織研磨均勻；將研磨均勻的勻漿液轉(zhuǎn)移至 DNA-Cleaning Column中(DNA-Cleaning Column 放入收集管中)，12000 rpm離心 2min；移除 DNA-Cleaning Column， 保留收集管內(nèi)上清液；向上述上清液中加入 1.6倍體積Buffer RL2(使用前請確認(rèn)已按照說明加入無水乙醇)，輕柔混勻；將 700μL混合液轉(zhuǎn)移至 RNA-only Column 中(純化柱放入收集管中)，12000rpm離心 1min，棄掉收集管中的廢液；將純化柱放回收集管中，將剩余混合液全部加入純化柱中，12000rpm，離心1min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入500μL Buffer RW1，12000rpm離心1min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入700μL Buffer RW2(使用前請確認(rèn)已按照說明加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄掉收集管中的廢液，重復(fù)1次；將純化柱放回收集管中，12000rpm空管離心2min，去掉離心柱中殘余的Buffer RW2；將純化柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，向純化柱的膜中央滴加50～200μL已于 65℃預(yù)熱的RNase-Free ddH2O，室溫放置2min。12,000rpm離心1min收集RNA溶液。為提高RNA產(chǎn)量，將離心得到的RNA溶液重新加至純化柱中，重復(fù)步驟1次。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):反應(yīng)1：5×gDNase Mix 2.0μL，Template(RNA)5μL,RNase-Free ddH2O 3μL,42℃ 2min，4℃ +∞；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2：反應(yīng)液1 10μL，5*RO-Easy Mix 4μL，RNase-Free ddH2O 6μL，37℃ 15min,85℃ 5s,4℃ +∞。

1.2.5實(shí)時定量PCR反應(yīng):采用SYBR Green法測定不同組目的基因的相對表達(dá)量。實(shí)時定量PCR引物見表1。PCR反應(yīng)體系：cDNA 0.4μL，上游引物(10M) 0.4μL，下游引物(10M)0.4μL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10μL，ddH2O 8.8μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 1min，72℃ 1min，40cycles；95℃ 15s,60℃ 1min,95℃ 15s,60℃ 15s。使用β-actin為內(nèi)參基因，目標(biāo)基因相對表達(dá)量RQ=2-△△CT(△CT=CT目標(biāo)-CT內(nèi)參，△△CT=△CT模型組-△CT對照組)，目標(biāo)基因相對表達(dá)量以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表1 引物序列

1.2.6ELISA測定大鼠血清總膽固醇含量:標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟相同)、待測樣品孔；在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋劑40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)；加樣將樣品加于酶標(biāo)孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μL，空白孔除外；溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60min；配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，沒空加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；顯色：每孔加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min；終止：每孔加入終止液50L，終止反應(yīng)；測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度。測定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計方法:采用SPSS15.0分析實(shí)驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)處理用單因素方差分析，以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1大鼠血清血脂含量測定:①與空白組相比，模型1組和模型2組TC、TG、LDL-C含量明顯增加升高(P<0.01)，HDL-C含量明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②同模型1組比較，模型2組TC、TG、LDL-C含量顯著升高(P<0.01)，HDL-C含量明顯降低(P<0.01)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表2。

表2 去卵巢手術(shù)對大鼠血清血脂的影響

2.2大鼠主動脈ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA水平比較:①與空白組相比，模型1組和模型2組ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA相對表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②模型2組ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR 相對表達(dá)量顯著低于模型1組(P<0.01)。詳見表3。

表3 大鼠主動脈ABCA1 ApoA1 CAV1 SRB1 VLDLR LDLR mRNA表達(dá)水平測定

3 討 論

高脂血癥常伴有脂質(zhì)代謝異常，如低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平升高，以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低。高脂血癥是心血管疾病的主要危險因素，而心血管疾病是全球死亡率的主要原因之一[4]。

動脈粥樣硬化是一種與脂質(zhì)和其他代謝改變相關(guān)的動脈炎癥性疾病[5]。它也是心臟病和中風(fēng)等心血管疾病的一個重要因素，世界各地的發(fā)病率和死亡率均增加[6]。動脈粥樣硬化主要由脂質(zhì)積累和免疫細(xì)胞過濾，以及分子相互作用引起，導(dǎo)致斑塊的發(fā)生、破裂和血栓形成[7]。動脈粥樣硬化分為很多種，其中主動脈粥樣硬化大多數(shù)無明顯臨床癥狀。許多研究高脂血癥大鼠疾病發(fā)生的分子機(jī)制集中在肝臟，而本研究從主動脈角度探索絕經(jīng)期對高脂血癥女性的影響的可能機(jī)制。

小窩蛋白的作用是介導(dǎo)脂蛋白分子的內(nèi)吞和外吞以及脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),小窩蛋白受體LDLR、SR-B1和ABCA1主要介導(dǎo)脂質(zhì)的外流。研究表明小窩蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)與脂質(zhì)代謝相關(guān),低密度脂蛋白受體(LDLR)、極低密度脂蛋白受體(VLDLR)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白a1(ABCA1)以及B類清道夫受體(SRB1) 共同組成脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[8]。 ApoA1為高密度脂蛋白的重要結(jié)構(gòu)蛋白，高密度脂蛋白(HDL)、LDL、極低密度脂蛋白(VLDL)以及蛋白質(zhì)膽固醇輸送蛋白(CETP)共同組成細(xì)胞外脂質(zhì)沉積系統(tǒng)。ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA水平的改變與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。

LDL、TC和TG與高脂血癥發(fā)生密切相關(guān)。高脂血癥是脂質(zhì)異常轉(zhuǎn)運(yùn)的直接結(jié)果，通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其受體在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與空白組相比，模型1組和模型2組TC、TG、LDL-C含量明顯增加(P<0.01)，HDL-C含量明顯降低(P<0.01)，提示造模成功，模型2組TC、TG、LDL-C含量明顯高于模型1組(P<0.01)，HDL-C含量明顯低于模型1組(P<0.01)，提示去卵巢手術(shù)+高脂血癥模型對大鼠脂質(zhì)代謝的影響更大。實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，模型1組和模型2組比空白組ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA表達(dá)量明顯降低，可能是雌性高脂血癥大鼠患病后脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)受體ABCA1等減少。模型2組與模型1組相比，ABCA1、ApoA1、CAV1、SRB1、VLDLR、LDLR mRNA表達(dá)量降低更顯著(P<0.01)，推測去卵巢手術(shù)后雌激素下降影響脂代謝，導(dǎo)致小窩蛋白(CAV1)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體(LDLR、VLDLR、SR-B1和 ABCA1) 、高密度脂蛋白結(jié)構(gòu)蛋白(ApoA1)mRNA的相對表達(dá)量降低幅度更大，提示模型2組可能由于去卵巢手術(shù)后雌激素的改變使得脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受阻更嚴(yán)重。

綜上，ELISA實(shí)驗結(jié)果提示造模成功，且去卵巢手術(shù)導(dǎo)致雌激素下降使得大鼠高脂血癥更嚴(yán)重。實(shí)時定量PCR結(jié)果提示去卵巢手術(shù)對高脂血癥大鼠主動脈的脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和脂質(zhì)沉積等影響更大，推測絕經(jīng)期可能對高脂血癥女性主動脈脂質(zhì)代謝的影響。絕經(jīng)期干預(yù)高脂血癥女性的可能機(jī)制有待完善，本研究通過去卵巢手術(shù)模擬女性絕經(jīng)期，從分子生物學(xué)水平揭示去卵巢手術(shù)可影響雌性高脂血癥大鼠主動脈脂代謝相關(guān)受體和脂蛋白結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA相對表達(dá)量和血清血脂含量，推測去卵巢+高脂血癥組大鼠可能脂質(zhì)代謝受阻更嚴(yán)重。為未來開展絕經(jīng)期干預(yù)女性高脂血癥發(fā)生與發(fā)展的完整分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為主動脈粥樣硬化確診的指標(biāo)選定提供分子生物學(xué)依據(jù)。