馬雨璇,王 娜,王 冰,李 鋼

(南京師范大學食品與制藥工程學院,分析測試中心,江蘇 南京 210023)

利伐沙班的商品名為拜瑞妥,是唑烷酮類選擇性Xa因子抑制劑,由德國拜耳公司和美國強生公司共同研發(fā),是全球第一個口服的Xa因子直接抑制劑的新型藥物[1-3]. 主要用于預防成人患者髖關節(jié)或膝關節(jié)置換以及非瓣膜性心房顫動術后引起的血栓形成,是抗血栓藥物中目前最有前景的藥物之一[4-6]. 與傳統(tǒng)抗凝藥華法林和阿哌沙班相比,利伐沙班具有可口服、受食物和藥物影響較小、給藥劑量可固定、出血風險低、藥效學和藥代動力學活性可預測、治療窗較寬且不需要常規(guī)醫(yī)療監(jiān)護等諸多優(yōu)點[7-8],是目前抗凝血藥研究的一個熱點.

對于同一藥物不同晶型的研究通常借助于 X-射線粉末衍射法(PXRD)、差示掃描量熱分析法(DSC),在相關文獻[9-11]中已有較多報道. 目前對利伐沙班的研究主要在藥理和合成工藝方面,對晶型的報道比較少. 從文獻[12-16]可知,利伐沙班存在多晶型,對藥物進行晶型研究在保證藥物的穩(wěn)定性、提高藥物的生物利用度、減少毒性和增進治療效果等方面都具有重要意義. 本實驗室主要對利伐沙班多晶型進行了制備,在制備純晶型的過程中出現了晶型Ⅰ和Ⅱ的混晶. 對多晶型藥物來說,有的晶型是有效的,有的是無效的,有的甚至是有害的,這就涉及到晶型定量分析的問題. 所以本文先利用PXRD和DSC對制備出的純晶型和混晶進行定性分析,再通過X-射線粉末衍射法中的K值法對晶型Ⅰ和Ⅱ(藥用晶型)的混晶體系進行定量分析[17],以晶型Ⅰ作為雜質確定含量,結果較為準確,為藥物質量控制提供保障,最后對藥用晶型Ⅱ的熱穩(wěn)定性進行了考察.

1 儀器與方法

1.1 儀器

天津天馬衡基儀器有限公司的FA2004型電子天平;河南太康科教器材廠的SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵;日本理學公司的D/max 2500VL/PC型陽極轉靶X射線衍射儀;美國Perkin Elmer公司的Analysis Diamond 差示掃描量熱儀.

1.2 材料

利伐沙班晶型Ⅰ由南京某公司提供;利伐沙班晶型Ⅱ及混晶由本實驗室轉晶制得.

1.3 X-射線粉末衍射法定性定量分析(PXRD)

測定條件為管壓:45 kV,管流:150 mA,Cu-Kα輻射,石墨彎晶單色器,發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°,接受狹縫(RS)=0.15 mm. 掃描速度:10 °/min(定性分析)以及1 °/min(定量分析),步長:0.02°.

1.4 差示掃描量熱法分析(DSC)

稱取樣品約2.0 mg放入鋁坩堝中密封,將坩堝放入 DSC 中進行測試,以氮氣為保護氣,升溫速率為 10 k/min,升溫范圍為 30 ℃～250 ℃,進行 DSC 分析.

1.5 X-射線粉末衍射定量分析K值法[17]

1.5.1 原理

K值法屬于一種特殊的內標法,也稱為基體清洗法,具有用樣少,各物相互不影響且可將偶然誤差降至最低限度的優(yōu)點,因此被采納用于定量分析利伐沙班晶型Ⅰ和Ⅱ混晶體系中雜質晶型Ⅰ的含量.

1.5.2 基本公式

(1)

當wj=wi時,式(1)可寫為:

(2)

(3)

1.5.3 方法

在進行定量分析時,首先按1∶1比例將標樣和參比物質均勻混合,經X射線衍射儀掃描后計算標樣和參比物質的特征衍射峰強度,并代入式(2)求出K值(K值為常數),然后在待測樣品中加入已知比例的參比物質并混合均勻,經X射線衍射儀掃描后計算標樣和參比物質的特征衍射峰強度,代入式(1)和(3)即可求出待測相在原樣品中的百分含量.

1.6 熱穩(wěn)定性考察

X射線粉末衍射儀(PXRD)及其原位高溫附件(In situ high temperature). 測定條件為管壓:45 kV,管流:150 mA,Cu Kα 輻射,石墨彎晶單色器,發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°,接受狹縫(RS)=0.15 mm. 掃描速度:10 °/min,步寬:0.02°. 真空條件下程序升溫,測定了利伐沙班晶型在不同溫度下晶型結構的變化. 根據熱分析的結果,設定25 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、150 ℃、170 ℃、190 ℃、220 ℃這8個溫度點,每個點恒溫1 min,檢測其結構變化.

圖1 利伐沙班的PXRD圖譜Fig.1 The PXRD patterns of Rivaroxaban

2 結果與討論

2.1 X-射線粉末衍射定性分析

對得到的樣品進行PXRD檢測(掃描速度:10 °/min),結果如圖1所示. 其中圖1(a)2θ=8.9°、16.4°、19.4°、19.8°、21.6°、22.4°、25.5°和26.6°是晶型Ⅰ的特征峰,圖1(b)2θ=12.7°、18.1°、19.2°、19.9°、20.8°、21.4°和25.8°是晶型Ⅱ的特征峰. 圖1(c)同時出現了晶型Ⅰ和Ⅱ的特征峰,由此判定此樣品為晶型Ⅰ和Ⅱ的一個混晶,并且從峰形上看以晶型Ⅰ的衍射峰為基礎出現了晶型Ⅱ的特征峰. 通常對混晶進行定量分析的時候,選取沒有重疊的最強峰作為特征峰,由圖可知2θ=22.4°的峰可以作為雜質晶型Ⅰ定量的特征峰.

2.2 X-射線粉末衍射定量分析K值法

本實驗采用α-Al2O3為參比物質. 按1∶1比例稱取純晶型Ⅰ樣品和α-Al2O3配制成混合樣品,置于瑪瑙研缽中,研磨20 min使其充分混勻,然后取混合樣品粉末適量裝入樣品架,將粉末樣品填滿樣品架并壓平壓緊,使其表面與樣品架表面齊平,制3個待測樣,然后分別以1 °/min進行掃描檢測. 衍射圖譜見圖2,取2θ=35.1°處峰為參比物質α-Al2O3的特征峰,2θ=22.4°處峰為晶型Ⅰ的特征峰,并將峰面積積分強度數據代入式(1)、(2)中進行K值的計算,取3次計算結果的平均值作為K值. 本方法測得晶型Ⅰ的K值為1.17. 計算結果見表1.

將未知含量的混晶樣品與α-Al2O3按2:1比例稱取,按上述方法制備3個待測樣品,以相同實驗條件進行PXRD檢測,衍射圖見圖3,將衍射峰強度數據代入式(1)和(3)即可求得未知含量混晶樣品中晶型Ⅰ的百分含量及質量. 晶型Ⅰ在被測物質中含量為40.37%,在原混晶樣品中的含量為60.55%. 檢測結果見表2.

圖2 α-Al2O3和利伐沙班晶型Ⅰ混合樣品的PXRD圖譜Fig.2 The PXRD patterns of α-Al2O3 and Rivaroxaban form Ⅰ

圖3 α-Al2O3和利伐沙班晶型Ⅰ含量的PXRD圖譜Fig.3 The PXRD patterns of α-Al2O3 and Rivaroxaban form Ⅰ content

表2 利伐沙班晶型Ⅰ含量的結果Table 2 The result of Rivaroxaban form Ⅰ content

表1 K值的結果Table 1 The result of K-value

表3 利伐沙班晶型Ⅰ含量的驗證結果Table 3 Results of the verification of Rivaroxaban form Ⅰ content

為了考察K值法對利伐沙班混晶定量分析的準確性,進行了驗證實驗. 取上一步的試樣加入純晶型Ⅰ,使未知含量的混晶樣品、α-Al2O3和純晶型Ⅰ的比例為2∶1∶1,研磨20 min使之充分混勻,制成3個待測樣,以相同實驗條件檢測,衍射圖見圖4,將衍射峰強度數據代入式(1)得到實際被測物質中晶型Ⅰ的平均百分含量55.17%,結果見表3. 與理論值55.28%進行對比,相對偏差為0.20%. 結果表明,本方法快速準確,簡單實用,可用于工廠的大批量分析工作.

2.3 差示掃描量熱法分析(DSC)

取樣品進行DSC分析,結果如圖5所示(圖中標明的溫度為峰頂溫度,并非起始溫度). 圖5(a)晶型Ⅰ只有一個吸熱峰,測量得到熔點和熱晗分別為232.7 ℃和117.8 J/g;圖5(b)晶型Ⅱ在197.6 ℃有一個弱的放熱峰,測量得到熱晗為-10.5 J/g,在231.8 ℃有一個吸熱峰,測量得到熱晗為101.7 J/g,該吸熱峰與晶型Ⅰ基本一致,推斷197.6 ℃的放熱峰為晶型Ⅱ由亞穩(wěn)晶型轉變?yōu)榉€(wěn)定的晶型Ⅰ,因此具有與晶型Ⅰ大致相同的熔點. 圖5(c)是混晶Ⅰ和Ⅱ的曲線,由此可見在189.1 ℃有一個放熱峰,熱晗為-7.5 J/g,與圖5(b)相比降低了8.5 ℃,這是因為含有晶型Ⅰ所導致,在232.1 ℃有一個熱晗為112.8 J/g的吸熱峰,3條曲線熔點峰一致,證明晶型Ⅱ最終轉變?yōu)榫廷?

圖5 利伐沙班的DSC曲線Fig.5 DSC curve of Rivaroxaban

圖4 加標回收實驗的PXRD圖譜Fig.4 The PXRD patterns of the standard added recovery experiment

圖6 利伐沙班晶型Ⅱ的變溫圖譜Fig.6 XRD patterns of Rivaroxaban form-Ⅱ at various temperature

2.4 熱穩(wěn)定性分析

從圖6可以看出,利伐沙班晶型Ⅱ在25 ℃～170 ℃之間晶型是穩(wěn)定的,沒有發(fā)生任何改變,與DSC分析結果相同. 在190 ℃時,晶型Ⅱ的兩個特征峰(2θ為12.7°和20.8°)強度減弱,開始出現晶型Ⅰ的特征峰(2θ為8.9°和25.5°),并且在22.3°處的峰強度明顯增加,整個衍射峰由純晶型Ⅱ變成晶型Ⅰ和Ⅱ的混晶. 這與圖5(b)中晶型Ⅱ在190 ℃出現朝下的尖銳放熱峰結果一致. 在220 ℃時晶型Ⅱ的特征峰完全消失,晶型Ⅰ的特征峰強度明顯變大,整個衍射峰由混晶變?yōu)榧兙廷?這與圖5中晶型Ⅱ具有與晶型Ⅰ相同的熔點結果一致.

3 結論

在制備純晶型的過程中,除了本文定量分析的最常出現的晶型Ⅰ和Ⅱ混晶外,還有晶型Ⅰ、Ⅳ和Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的混晶. 3種混晶樣品在常溫放置一段時間后,都會發(fā)生晶型的轉變. 晶型Ⅰ和Ⅱ混晶在一段時間之后,晶型Ⅰ的衍射峰強增加,晶型Ⅱ的峰強降低,亞穩(wěn)定晶型Ⅱ逐漸向穩(wěn)定晶型Ⅰ轉變. 晶型Ⅰ和Ⅳ混晶晶型在一段時間之后,晶型Ⅳ的特征峰消失,變成了純晶型Ⅰ. 晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的混晶在一段時間后,晶型Ⅳ特征峰消失,晶型Ⅱ峰強降低,晶型Ⅰ峰強增加,變成了晶型Ⅰ和Ⅱ的混晶. 所以本文只對晶型Ⅰ和Ⅱ混晶進行了定量分析.

本文20 min的研磨除了會使晶型強度降低以外,對定量分析沒有影響. 但是過度的研磨以及過量的研磨時間對定量分析有沒有影響,需要進一步考察.