沈良賢，范原銘，李 泉，陳祖翼，邱孝蘭，周學(xué)剛，陶 鳳△

重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院：1.科教科；2.普外二科；3.檢驗(yàn)科，重慶 401220；4.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州遵義 563000；5.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院超聲科，重慶 401220

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(NG)是單純性甲狀腺腫的后期表現(xiàn)形式。據(jù)報(bào)道，NG的發(fā)病率為6%～7%，且病史較長的NG可發(fā)生癌變[1-2]。有研究表明，瑞典長期實(shí)施的補(bǔ)碘計(jì)劃并沒有影響缺碘或碘豐富地區(qū)甲狀腺腫及甲狀腺癌的發(fā)生趨勢[3]。因而除碘外，仍有其他多種因素參與NG的發(fā)生與發(fā)展。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸和同型半胱氨酸代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶。目前研究最多，且與疾病關(guān)系密切的MTHFR基因單核苷酸突變位點(diǎn)為C677T和A1298C，可導(dǎo)致熱不穩(wěn)定性和(或)酶活性降低[4]。相關(guān)研究認(rèn)為，這個(gè)基因的遺傳變異會(huì)影響DNA合成、修復(fù)及甲基化過程，從而影響甲狀腺癌及自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)的易感性[5-7]。然而，MTHFR基因多態(tài)性與NG的相關(guān)研究鮮見報(bào)道，為此本研究旨在尋找MTHFR C677T和A1298C基因多態(tài)性與NG的相關(guān)性，為NG的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院2018年8月至2019年11月經(jīng)術(shù)后病理確證的甲狀腺功能正常的NG患者73例作為病例組。另選取經(jīng)高清晰超聲檢查甲狀腺組織正常及甲狀腺功能正常的76例體檢健康者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2015年最新出版的美國甲狀腺協(xié)會(huì)關(guān)于甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌的管理指南進(jìn)行病理診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)代謝性疾病(高血壓、糖尿病、血脂異常)；(2)甲狀腺疾病(甲狀腺炎、甲狀腺良惡性腫瘤)；(3)其他惡性腫瘤；(4)精神障礙。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及患者知情同意。

1.2儀器與試劑 Hema3200PCR擴(kuò)增儀、HemaTGL-16R冷凍離心機(jī)購自珠海黑馬公司；一次性乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)真空抗凝管；血液基因組DNA抽提試劑盒升級(jí)款和PCR擴(kuò)增試劑購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取 抽取外周靜脈血2 mL，EDTA-Na2抗凝，-80 ℃保存待用。采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒升級(jí)款提取DNA。

1.3.2引物設(shè)計(jì)及合成 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，rs1801133上游引物5′-AACAATGTTTAATCCGGTGCC-3′，下游引物5′-ATCCTTTGGGATCTTT-3′；rs1801131上游引物5′-CACTCCAGCATCACTCACTTTG-3′，下游引物5′-AAGAAGTTTGCATGCTTGTGG-3′。

1.3.3PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系25.0 μL，ddH2O 18.3 μL、10.0×緩沖液(含MgCl2)2.5 μL、dNTP (10 mmol/L)1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、Taq酶0.2 μL、Primer mix 2.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后按94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)38次，末次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

1.3.4基因測序 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司，利用一代Sanger測序的方法，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.3.5基因型分析 通過sequence analysis軟件對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行初步分析，并通過DNAMAN6.0.3.99軟件與GenBank(MTHFR NG_013351)的基因序列進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1兩組年齡、性別情況比較 病例組中，男11例，女62例；年齡21～80歲，平均(51.37±10.92)歲，其中年齡>30歲的占96.05%，>60歲的占23.68%。對(duì)照組中，男40例，女36例；年齡17～92歲，平均(52.29±16.46)歲，其中年齡>30歲的占97.56%，>60歲的占19.51%。病例組與對(duì)照組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2兩組男女基因型分布比較 病例組、對(duì)照組及NG組+對(duì)照組基因型C677T、A1298C男女分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組男女基因型分布比較(n)

2.3MTHFR C677T和A1298C基因型或等位基因的分布情況 兩組MTHFR C677T和A1298C基因型頻數(shù)均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。病例組A1298C多態(tài)性CC基因型頻數(shù)及C等位基因頻數(shù)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。病例組和對(duì)照組C677T多態(tài)性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 MTHFR C677T和A1298C基因型或等位基因的分布情況[n(%)]

3 討 論

MTHFR位于第1號(hào)染色體1p36.22，全長27.374 kb，共有外顯子12個(gè)，其編碼656個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，負(fù)責(zé)催化5,10-亞甲基四氫葉酸不可逆地還原為5-甲基四氫葉酸。自2003年人類基因組計(jì)劃發(fā)現(xiàn)MTHFR以來，在世界范圍內(nèi)已發(fā)表許多關(guān)于MTHFR的分子和流行病學(xué)研究，但其與甲狀腺功能不全之間的關(guān)系的相關(guān)研究較少，且結(jié)果存在爭議。

甲狀腺激素是酪氨酸碘化物，當(dāng)MTHFR基因突變時(shí)，MTHFR酶活性降低，可通過影響酪氨酸合成，從而影響甲狀腺激素的合成；其還可通過影響甲狀腺互向三碘甲狀腺原氨酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致甲狀腺功能減退。促甲狀腺激素(TSH)是主要的有絲分裂因子，任何使TSH水平升高的物質(zhì)都會(huì)刺激結(jié)節(jié)的形成[8]，提示MTHFR基因多態(tài)性有可能是NG形成的原因之一。ARAKAWA等[5]研究表明，在日本人群中未發(fā)現(xiàn)C677T或A1298C多態(tài)性與導(dǎo)致甲狀腺功能減退或亢進(jìn)的AITD相關(guān)；且C677T和A1298C的基因型和等位基因頻率也不影響AITD的預(yù)后。ABU-HASSAN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，約旦女性人群C677T多態(tài)性與甲狀腺功能減退或亢進(jìn)的AITD無關(guān)，而A1298C多態(tài)性可能是影響甲狀腺功能減退或亢進(jìn)的AITD發(fā)生的因素，且CC、TA和TC單倍型可能是甲狀腺功能減退發(fā)生的影響因素。CHEN等[6]的薈萃分析顯示，MTHFR C677T多態(tài)性與甲狀腺疾病之間沒有相關(guān)性，MTHFR C677T純合子TT基因型多態(tài)性與白種人和亞洲人的甲狀腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)。而本研究發(fā)現(xiàn)C677T多態(tài)性與NG沒有相關(guān)性，提示C677T多態(tài)性與甲狀腺癌相關(guān)，而與NG可能沒有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，A1298C基因多態(tài)性可降低NG發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，與ABU-HASSAN等[7]和ARAKAWA等[5]的結(jié)果相反。上述研究中的研究對(duì)象是自身免疫性甲狀腺疾病患者，因此，導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因可能跟種族、地理及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)等因素的不同有關(guān)[9]，而本研究中的NG是不伴有甲狀腺功能異常的非毒性甲狀腺腫的后期表現(xiàn)形式，可能與甲狀腺激素水平降低，TSH水平反饋性升高及TSH長期慢性刺激甲狀腺組織有關(guān)[2]，表明MTHFR基因A1298C位點(diǎn)多態(tài)性可能通過影響甲狀腺激素的合成、轉(zhuǎn)化來降低NG發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中NG患者年齡>30歲的占96.05%，>60歲的占23.68%，全國自1996年開始普遍實(shí)行食鹽碘化，說明大部分患者可能在中青年時(shí)期缺碘，甲狀腺已發(fā)生病理改變或已經(jīng)有結(jié)節(jié)形成，在食鹽碘化后NG可能仍舊在發(fā)生，或并未得到治療，或也沒有向惡性發(fā)展。因此，除碘外，還可能有其他因素影響NG的發(fā)生、發(fā)展。也有研究表明，補(bǔ)碘后結(jié)節(jié)性甲狀腺腫DNA指數(shù)、異倍體率、增殖指數(shù)均明顯增高[10]。而MTHFR除了可以影響甲狀腺激素的合成及轉(zhuǎn)化外，還可以為體內(nèi)嘌呤、嘧啶的合成及DNA甲基化提供甲基，從而影響DNA的合成、修復(fù)及DNA甲基化，而甲基化和DNA合成在癌癥的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因A1298C位點(diǎn)多態(tài)性與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明A1298C位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)NG可能是一種保護(hù)因子。

本研究對(duì)照組中C677T的T等位基因頻率、A1298C的等位基因頻率(分別為36.18%、23.03%)與YANG等[9]報(bào)道的中國人群的等位基因頻率(分別為36.9%、22.4%)接近，說明對(duì)照組選擇無偏差。病例組、對(duì)照組及病例組+對(duì)照組C677T、A1298C基因型男女分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與李丹丹等[12]、VIDUDALA等[13]報(bào)道的變異頻率沒有性別特異性的結(jié)果一致。

本研究的局限性在于：(1)樣本量相對(duì)較小，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)少且只選擇了兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析；(2)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素的缺乏限制了基因與環(huán)境相互作用的分析；(3)排除標(biāo)準(zhǔn)中，除了通過甲狀腺超聲影像檢查及血清學(xué)檢測甲狀腺功能外，僅依靠其既往病史、空腹血糖排除代謝性疾病。在今后的研究中還應(yīng)擴(kuò)大樣本量，評(píng)估基因、基因環(huán)境和同一基因中不同單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)之間的相互作用，執(zhí)行更嚴(yán)格的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，將MTHFR多態(tài)性納入易感個(gè)體的篩選和檢查。

綜上所述，MTHFR基因A1298C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能通過影響甲狀腺激素的合成轉(zhuǎn)化及DNA甲基化、合成修復(fù)等影響NG發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而C677T位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與NG的發(fā)生無相關(guān)性。