顧承真李 婷曾碧雪李文娟吳鳳芝曾任森

（1.福建農林大學生命科學學院，福建 福州350002； 2.福建農林大學農學院，福建 福州350002；3.東北農業(yè)大學園藝園林學院，黑龍江 哈爾濱150030）

分蘗洋蔥Allium cepaL.var.agrogatumDon.屬于百合科蔥屬一年生草本植物，是洋蔥的變種之一。在我國黑龍江、吉林等地廣泛種植，資源豐富。分蘗洋蔥是一種獨具特色的藥食同源的保健品，營養(yǎng)豐富，藥用價值也較高。分蘗洋蔥鱗莖中含有大蒜素等多種植物殺菌素，具有很強的殺菌能力［1?2］。近年來學者對其化學成分進行了研究，發(fā)現(xiàn)分蘗洋蔥主要成分包括分蘗蔥頭苷、黃酮類化合物［3?4］、含硫化合物、前列腺素A1［5］、甾體皂苷［6］、微量元素和氨基酸等［7］。研究表明黃酮類化合物對自然界中許多病原微生物具有抑制和殺滅作用［8］。目前，天然產物的抑菌作用受到了廣泛關注，尤其是黃酮類化合物。黃瓜根分泌物中含有的7，8?苯并黃酮能夠顯著抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)［9］。但分蘗洋蔥中含有的黃酮類成分對農作物病原菌的抑制作用有待于研究。

番茄枯萎病是由半知菌亞門鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌Fusarium.oxysporiumSchl.引起的一種土傳性、系統(tǒng)性病害［10?11］。前期研究發(fā)現(xiàn)分蘗洋蔥乙醇提取物對番茄枯萎病病原菌的生長具有抑制作用，但具有抑制番茄枯萎病病原菌生長的物質基礎尚不明確。因此，本研究從分蘗洋蔥中分離得到2 個黃酮、1 個木脂素類化合物和1 個氨基酸，并用微量稀釋法測定了這些化合物對番茄枯萎病病原菌生長的影響。

1 材料

斜式N?1100S?W 旋轉蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；VS?840 K?U 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；BS?100A自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；1000Y 多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；HVE?SO 型高壓滅菌鍋（華粵企業(yè)集團有限公司）；SHB?ⅢA 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；ZF?20D 型暗箱三用紫外分析儀（驥輝分析儀器有限公司）；FPQ?300CY?30D 型人工氣候箱（寧波萊?？萍加邢薰荆F254薄層硅膠（200 mm×200 mm，青島海浪硅膠干燥劑廠）；Bruker 600 MHz 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Agilent 1290?6545 飛行時間質譜儀測定（美國Agilent 公司）；半制備液相色譜（江蘇漢邦科技有限公司）；Ultimate XB?C18半制備色譜柱（21.2 mm×250 mm，5 μm，月旭科技股份有限公司）。

分蘗洋蔥由東北農林大學吳鳳芝教授提供并鑒定為正品，番茄枯萎病病原菌Fusarium oxysporumf.sp.LycopersiciSnyder et Hansen 菌株由福建農林大學作物科學學院作物抗性與化學生態(tài)學研究所提供。

2 提取與分離

15 kg 分蘗洋蔥剝去鱗莖外皮，粉碎機粉碎成泥，在室溫下用95%乙醇浸提3 次，每次24 h，合并3 次提取液、減壓濃縮得到浸膏（1.6 kg）。適量蒸餾水稀釋，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚萃取部分（50 g）、乙酸乙酯萃取部分（210 g）、水部分（1.3 kg）。取分蘗洋蔥乙醇提取物的乙酸乙酯部分，加少量甲醇溶解、過濾，上凝膠Sephadex LH?20 柱，用甲醇?水（10 ∶90～100 ∶0）梯度洗脫，得到4 個部分Fr.A～D。Fr.A 上C18柱，用甲醇?水（10 ∶90～100 ∶0）洗脫，得到Fr.A1～A5，F(xiàn)r.A2 經MCI 柱純化，甲醇?水（20 ∶80）洗脫，得化合物2（53 mg）；Fr.A4 上MCI 柱純化，用甲醇?水甲醇?水（35 ∶65）洗脫，得化合物1（141 mg）；Fr.A5 上MCI 柱純化，再用半制備液相甲醇?水（25 ∶ 75）純化，得化合物3（15 mg）。Fr.B 用C18柱分段甲醇?水（10 ∶90～100 ∶0），得到6 個部分Fr.B1～B6。Fr.B2 上MCI柱純化，用甲醇?水（40 ∶60）洗脫，得化合物4（23 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：黃色粉末，分子式C15H10O7。ESI?MSm／z：303.0 ［M ＋H］＋。1H?NMR（DMSO?d6，600 MHz）δ：12.46（1H，s，OH?5），10.80（1H，s，OH?7），9.63（1H，s，OH?4′），9.35（1H，s，OH?3），9.34（1H，s，OH?3′），7.70（1H，s，H?2′），7.57（1H，d，J＝8.5 Hz，H?6′），6.91（1H，d，J＝8.5 Hz，H?5′），6.51（1H，s，H?8），6.22（1H，s，H?6）；13C?NMR（DMSO?d6，150 MHz）δ：156.6（C?2），136.7（C?3），176.5（C?4），162.4（C?5），98.6（C?6），164.6（C?7），94.1（C?8），156.8（C?9），104.3（C?10），122.6（C?1′），115.6（C?2′），145.7（C?3′），147.3（C?4′），116.1（C?5′），120.8（C?6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］ 報道一致，故鑒定為槲皮素。

化合物2：黃色粉末，分子式C21H20O12。ESI?MSm／z：465.1 ［M ＋H］＋。1H?NMR（CD3OD，600 MHz）δ：6.36（1H，s，H?2′），7.55（1H，dd，J＝10.5，1.98 Hz，H?6′），7.28（1H，d，J＝10.44 Hz，H?5′），7.73（1H，s，H?8），6.16（1H，s，H?6），4.90（1H，d，J＝8.76 Hz，H?1″），3.52（1H，m，H?2″），3.56（1H，m，H?3″），3.48（1H，m，H?4″），3.44（1H，m，H?5″），3.93（1H，dd，J＝2.5，15.4 Hz，H?6a″），3.73（1H，dd，J＝6.54，15.4 Hz，H?6b″）；13C?NMR（CD3OD，150 MHz）δ：148.4（C?2），138.1（C?3），177.6（C?4），162.8（C?5），99.5（C?6），165.8（C?7），94.6（C?8），158.4（C?9），104.7（C?10），127.8（C?1′），117.7（C?2′），146.9（C?3′），148.2（C?4′），116.6（C?5′），121.4（C?6′），103.8（C?1″），74.9（C?2″），78.5（C?3″），71.5（C?4″），77.7（C?5″），62.6（C?6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］ 報道一致，故鑒定為槲皮素?4′?O?β?D?葡萄吡喃糖苷。

化合物3：無色粉末，分子式C22H26O8。ESI?MSm／z：419.1 ［M ＋H］＋。1H?NMR（DMSO?d6，600 MHz）δ：3.09（2H，m，H?1／5），3.45（2H，m，H?4b／8b），3.73（2H，m，H?4a／8a），4.86（2H，d，J＝4.8 Hz，H?2／6），3.82（12 H，s，4?OCH3），5.43（2H，s，OH），6.61（4H，s，H?2′／6′／2″ ／6″）；13C?NMR（DMSO?d6，150 MHz）δ：53.7（C?1／5），56.1（4?OCH3），71.1（C?4／8），85.5（C?2／6），103.7（C?2′／6′／2″／6″），131.1（C?1′／1″），134.9（C?4′／4″），148.0（C?3′／5′／3″／5″）。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］ 報道一致，故鑒定為diasy?ringaresinol。

化合物4：白色粉末，分子式C11H12N2O7。ESI?MSm／z：205.1 ［M＋H］＋。1H?NMR（D2O，500 MHz）δ：7.62（1H，d，J＝9.5 Hz，H?4），7.42（1H，d，J＝8.2 Hz，H?7），7.19（1H，s，H?2），7.16（1H，t，J＝7.1 Hz，H?6），7.08（1H，t，J＝7.0 Hz，H?5），3.93（1H，dd，J＝4.8，8.1 Hz，?CH），3.38（1H，dd，J＝4.8，15.3 Hz，?CH2），3.19（1H，dd，J＝8.1，15.3 Hz，?CH2）；13C?NMR（D2O，125 MHz）δ：174.6（?CO），137.3（C?7a），126.6（C?3a），124.9（C?2），122.1（C?6），119.4（C?4），118.4（C?5），112.0（C?7），107.5（C?3），55.1（?CH），26.4（?CH2）。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］ 報道一致，故鑒定為色氨酸。

4 生物活性

4.1 分蘗洋蔥乙醇提取物抑菌活性測試 培養(yǎng)基制備（PDA）為稱取去皮土豆300 g，切碎加水400 mL 蒸煮30 min，用紗布過濾得澄清濾液，加入葡萄糖、瓊脂粉各30 g，攪拌至充分溶解，定容至1 500 mL 然后分裝到7 個250 mL 的三角瓶中，置于高壓滅菌鍋滅菌中滅菌30 min，待用。

分蘗洋蔥乙醇提取物浸膏用甲醇溶解與PDA培養(yǎng)基按一定比例混勻（培養(yǎng)皿中分蘗洋蔥乙醇提取物的質量濃度為5 mg／mL），作為處理組，加等同量甲醇的PDA 培養(yǎng)基作為對照組。用打孔器將番茄枯萎病病原菌的菌餅打成直徑0.5 cm 的圓餅，接種在培養(yǎng)基上，置于28 ℃、相對濕度60%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后觀察其生長情況。結果，對照組長滿了病原菌，處理組上的病原菌幾乎沒有生長，表明分蘗洋蔥乙醇提取物能顯著抑制番茄枯萎病病原菌的生長，在5 mg／mL 的質量濃度下，番茄枯萎病病原菌幾乎不能生長。

4.2 各化合物抑菌活性測試 使用微量稀釋法，通過96 孔細胞培養(yǎng)板完成4 個化合物對番茄枯萎病病菌的最低抑制濃度值（MIC）的測定。陽性對照藥品為伏立康唑，稱取20 mg，甲醇溶解制成2 mg／mL貯備液。

稱量2 mg 刃天青粉末，制備成質量濃度為100 μg／mL 的指示劑，加入到96 孔酶標板的第11列孔中，將7 mL 質量濃度為143 μg／mL 的刃天青溶液和3 mL 含真菌的培養(yǎng)液混勻，使刃天青的最終質量濃度為100 μg／mL，分別往第1～10 列和第12 列的每個培養(yǎng)孔中加入100 μL，往每行的第一個孔中加入90 μL 100 μg／mL 刃天青指示劑和10 μL質量濃度為2 mg／mL 的化合物或陽性對照貯備液，混勻，從中取100 μL 溶液打到第2 個孔中，依此類推，一直到第10 個孔，最后移走100 μL。化合物和陽性對照貯備液的質量濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19 μg／mL，每個96 孔培養(yǎng)板的前6 行是化合物處理的，后2 行分別是含甲醇和伏立康唑的對照。最后，將培養(yǎng)板放在25 ℃培養(yǎng)箱中，直至第12 列培養(yǎng)液有藍色變?yōu)榉奂t色，統(tǒng)計每個化合物的MIC值，整個過程約需要13～15 h。

結果，化合物1～2 對對番茄枯萎病病原菌具有較好的抑制作用，最低抑制濃度（MIC）分別為25.0、12.5 μg／mL，陽性對照伏立康唑的最低抑制濃度（MIC）為0.39 μg／mL，其他2 個化合物對番茄枯萎病病原菌生長無明顯影響。

5 討論

本研究從分蘗洋蔥乙醇提取物中分離獲得4 個化合物，發(fā)現(xiàn)1～2 對番茄枯萎病病原菌生長具有較好的抑制作用，可為分蘗洋蔥的利用提供理論依據(jù)，并為合成新型除菌劑提供先導化合物。另外，番茄枯萎病為土傳病害，分蘗洋蔥與番茄間作能否抑制番茄枯萎病，分蘗洋蔥根系分泌物中是否含有槲皮素及其具體含量尚不明確，還有待進一步研究。