姚培學(xué) 楊勝紅 陳杰 歐陽(yáng)瑤

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院PCCM 呼吸一病區(qū)（貴州遵義563000）

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）是常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率和病死率高，嚴(yán)重影響人類的壽命和生活質(zhì)量，給全球醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)巨大的壓力和挑戰(zhàn)［1-2］。氣道重塑是慢阻肺的特征性病理改變，支氣管成纖維細(xì)胞（bronchial fibroblasts，BF）是氣道重塑的主要效應(yīng)細(xì)胞［3-4］。慢阻肺氣道重塑的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前已成為慢阻肺治療的難點(diǎn)［5-6］。白介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）是最重要的炎癥細(xì)胞因子，在氣道重塑中發(fā)揮重要的作用［7］。自噬是真核生物細(xì)胞中降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)受損、變性、衰老的長(zhǎng)壽命蛋白及細(xì)胞器的過(guò)程。自噬在慢阻肺的研究中尚有爭(zhēng)議，不同的細(xì)胞類別自噬水平不同［8-9］。IL-17A 通過(guò)調(diào)控自噬參與多種慢性炎癥及纖維增生性疾病［7，10-12］。然而IL-17A 是否能夠通過(guò)抑制自噬影響支氣管成纖維細(xì)胞膠原代謝，從而參與慢阻肺氣道重塑的形成尚未明確。本研究從細(xì)胞水平驗(yàn)證上述假設(shè)，闡明IL-17A 對(duì)支氣管成纖維細(xì)胞增殖、自噬及自噬后膠原降解的影響，為慢阻肺氣道重塑的靶向治療提供新的理論依據(jù)和手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，重約150～180 g，用于原代支氣管成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，購(gòu)買于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物使用許可證號(hào)：00024737］，飼養(yǎng)于貴州省基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑膠原酶聯(lián)合消化液購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；波形蛋白免疫熒光一抗、FITC 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗均購(gòu)自BOSTER 公司；兔抗大鼠Beclin-1 、抗自噬微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）A/B單克隆抗體、p62 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；重組大鼠IL-17A 購(gòu)自美國(guó)RD 公司；雷帕霉素購(gòu)自MCE 公司；Anti-GAPDH antibody 購(gòu)自Proteintech 公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP-1）ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BF 的分離與培養(yǎng)SD 大鼠頸椎脫臼處死后，以75%酒精浸泡消毒，取出完整的氣管與肺組織，浸泡在含有1%青鏈霉素的PBS 液中，剝離支氣管組織，并將其剪碎，應(yīng)用酶聯(lián)合消化法+組織塊貼壁法，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，之后每3 天換液1 次，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代并鑒定。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度IL-17A 對(duì)BF 細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠BF，以8 × 103/孔的密度接種于96 孔板中（100 μL/孔），待細(xì)胞貼壁后分別予以不同濃度（0、5、10、20、40、80 ng/mL）IL-17A 干預(yù)。每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h；隨后加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育1 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度，重復(fù)3 次檢測(cè)取平均值。

1.2.3 透射電鏡觀察大鼠BF 細(xì)胞的自噬情況對(duì)照組：不予以任何處理的BF；雷帕霉素組：2 μmol/L雷帕霉素處理的BF；雷帕霉素+IL-17A組：2 μmol/L雷帕霉素體外誘導(dǎo)BF 自噬后加入20 ng/mL IL-17A對(duì)自噬活化的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)；IL-17A 組：20 ng/mL IL-17A 體外誘導(dǎo)的BF。各組分別培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，PBS 液洗2 次后，3%戊二醛、1%鋨酸雙固定，包埋，聚合，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙染色后透射電鏡下觀察各組BF 細(xì)胞內(nèi)自噬泡情況。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62

蛋白的表達(dá)收集各組細(xì)胞提取蛋白，用BCA 法蛋白定量后電泳，用轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入LC3、p62、GAPDH 抗體4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色、曝光，保存圖片。使用Image J 軟件進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5 次。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中MMP-1、TIMP-1的表達(dá)水平采用15 mL無(wú)菌離心管收集各組細(xì)胞上清液，4 ℃離心機(jī)離心25 min，2 500 r/min，收集上清液為ELISA 檢測(cè)樣品，按照酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行MMP1 及TIMP1 的測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0 進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代BF 細(xì)胞形態(tài)及鑒定酶聯(lián)合消化法+組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代BF 細(xì)胞1 d 后，在倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)單個(gè)BF 細(xì)胞已貼壁，培養(yǎng)3 d 后幾乎所有細(xì)胞變成梭形，偶可見(jiàn)多邊形細(xì)胞，培養(yǎng)至第5 天見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)伸展，單層融合，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、旋渦狀或放射狀（圖1）。經(jīng)鑒定，BF 表面標(biāo)記蛋白vimentin 呈陽(yáng)性（圖2）。

圖1 酶聯(lián)合消化法+組織塊貼壁法分離培養(yǎng)原代BF（×100）Fig.1 Enzymatic digestion and tissue adherent method to isolate and culture primary BF（×100）

圖2 細(xì)胞免疫熒光鑒定BF 中vimentin 的表達(dá)（×100）Fig.2 Cellular immunofluorescence identification of vimentin expression in BF（×100）

2.2 不同濃度IL-17A誘導(dǎo)大鼠BF增殖的影響用CCK-8 法檢測(cè)（0、5、10、20、40、80 ng/mL）IL-17A誘導(dǎo)BF 的增殖情況，以確定最佳的IL-17A 濃度（圖3）。結(jié)果顯示，IL-17A 濃度為20 ng/mL 時(shí)BF增殖活力最強(qiáng)。

2.3 透射電鏡觀察IL-17A 對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)BF 的自噬情況透射電鏡觀察IL-17A 對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)BF自噬情況（圖4、5）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在雷帕霉素誘導(dǎo)的BF 細(xì)胞中，自噬泡數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+IL-17A組及IL-17A 組自噬泡數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；與雷帕霉素+IL-17A 組相比，IL-17A 組BF 細(xì)胞的自噬水平進(jìn)一步降低（P＜0.05）。

圖3 不同濃度IL-17A 誘導(dǎo)BF 增殖的影響Fig.3 Effects of different concentrations of IL-17A on the proliferation of BF

2.4 調(diào)控自噬后IL-17A 對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)BF 自噬的影響Western blot 檢測(cè)雷帕霉素促進(jìn)BF 自噬后IL-17A 對(duì)BF 細(xì)胞自噬的影響（圖6）。與對(duì)照組相比，雷帕霉素組及IL-17A+雷帕霉素組中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值上調(diào)，p62 的表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）；與雷帕霉素組相比，IL-17A+雷帕霉素組及IL-17A 組中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值下調(diào)，p62 的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）；與IL-17A+雷帕霉素組相比，IL-17A 組LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值進(jìn)一步降低，p62 的表達(dá)水平進(jìn)一步增強(qiáng)（P＜0.05）。

圖4 透射電鏡觀察IL-17A 對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)BF 的自噬情況Fig.4 Transmission electron microscope observation of IL-17A on rapamycin-induced autophagy in BF

圖5 各組BF 細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of intracellular AV number of BF in each group

圖6 Western blot 檢測(cè)調(diào)控自噬后IL-17A 對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)BF 自噬的影響Fig.6 Western blot detection of the effect of IL-17A on rapamycin-induced autophagy in BF after regulating autophagy

2.5 ELISA 檢測(cè)各組BF 細(xì)胞上清液中MMP-1、TIMP-1 的表達(dá)量ELISA 檢 測(cè)IL-17A 對(duì)BF 細(xì) 胞上清液中MMP-1、TIMP-1 的表達(dá)量（圖7）。與對(duì)照組相比，雷帕霉素組中MMP-1 表達(dá)水平升高，TIMP-1 表達(dá)水平降低（P＜0.05），IL-17A 組MMP-1蛋白表達(dá)水平降低，TIMP-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與雷帕霉素組相比，IL-17A +雷帕霉素組、IL-17A 組中MMP-1 表達(dá)水平降低，TIMP-1 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

圖7 ELISA 檢測(cè)各組BF 細(xì)胞上清液中MMP-1、TIMP-1 的表達(dá)量Fig.7 ELISA to detect the expression of MMP-1 and TIMP-1 in the supernatant of BF cells in each group

3 討論

氣道重塑是慢阻肺的病理基礎(chǔ)。氣道重塑是指氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞功能改變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生導(dǎo)致黏液分泌增加、細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)改變，引發(fā)不可逆性氣流受限［13］。氣道重塑與慢阻肺預(yù)后不良密切相關(guān)，直接影響患者病情轉(zhuǎn)歸。BF 在氣道重塑中發(fā)揮著重要作用［7］。因此，研究BF 的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)慢阻肺治療尤為重要。

IL-17A 作為一種促炎因子，能放大炎性反應(yīng)和參與炎癥后纖維化過(guò)程［14-15］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，慢阻肺患者支氣管肺泡灌洗液、痰液及肺組織中IL-17A 的表達(dá)顯著升高，且與肺功能的下降程度、血清C 反應(yīng)蛋白水平和痰液中中性粒細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)［16-18］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，慢阻肺患者血清中IL-17A 水平升高，其對(duì)診斷慢阻肺和判斷慢阻肺預(yù)后有較高的敏感性和特異性［19］。另有研究證實(shí)IL-17A 可影響成纖維細(xì)胞細(xì)胞因子、膠原蛋白的合成，促進(jìn)氣道炎癥及氣道重塑［20］，但I(xiàn)L-17A 是否會(huì)影響B(tài)F 增殖和膠原降解尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度IL-17A 處理BF 后，BF 的增殖活力均增強(qiáng)，其中最佳增殖濃度為20 ng/mL。提示IL-17A 誘導(dǎo)BF 增殖，導(dǎo)致BF 肥厚，同時(shí)能夠抑制膠原降解，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。

自噬與IL-17A在慢阻肺氣道重塑中的關(guān)系密不可分，研究證實(shí)IL-17A可通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR及PI3K/AKT/Bcl2自噬相關(guān)通路，降低自噬水平［21］，另外，通過(guò)增強(qiáng)自噬，可以有效改善TGF-β細(xì)胞模型腎纖維化的程度，保護(hù)細(xì)胞模型損傷［22］。因此，本研究以BF 細(xì)胞自噬為主要切入點(diǎn)，觀察調(diào)控BF細(xì)胞自噬水平對(duì)其膠原降解的影響，同時(shí)觀察IL-17A 對(duì)BF 自噬的作用，為改善氣道重塑提供新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17A 能夠抑制BF 細(xì)胞自噬，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值減少，同時(shí)自噬經(jīng)典底物蛋白p62 表達(dá)的減少。另外透射電鏡結(jié)果顯示IL-17A組細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量較正常對(duì)照組減少，進(jìn)一步佐證了IL-17A能夠抑制BF細(xì)胞自噬。雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)了IL-17A的作用。此外，雷帕霉素誘導(dǎo)BF 自噬后，MMP-1 的表達(dá)水平升高，而TIMP-1的表達(dá)水平降低，加入IL-17A 刺激后MMP-1 的表達(dá)水平下調(diào)，TIMP-1 的分泌增多，提示IL-17A 與自噬和膠原降解的調(diào)控有一定聯(lián)系，自噬可促進(jìn)BF細(xì)胞膠原降解。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)原代BF 細(xì)胞，利用雷帕霉素誘導(dǎo)BF 自噬，觀察IL-17A 對(duì)BF自噬和其膠原降解的影響。本研究發(fā)現(xiàn)IL-17A對(duì)BF 具有促增殖作用，并且可以抑制BF 的自噬和膠原降解，提示氣道重塑的發(fā)生與BF 自噬和膠原降解密切相關(guān)。因此，本課題研究人員將繼續(xù)從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入研究IL-17A 抑制自噬的分子機(jī)制，為慢阻肺氣道重塑的防治和靶向治療提供更多可靠且有意義的理論支持。