許曉山 龐正寶 楊軍 周一峰 夏臣杰 丁心逸

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是一類以骨量流失，骨微結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致骨骼脆性增加的代謝性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有25.6%的50歲以上婦女患有PMOP[1]，并由此導(dǎo)致的脆性骨折發(fā)生率高達(dá)40%[2]。盡管市場(chǎng)上存在各類抗PMOP的藥物，如二磷酸鹽、活性維生素D等，但由于這些化學(xué)合成藥物存在毒副反應(yīng)且適應(yīng)性不廣，使得天然植物來源的中草藥逐漸成了新藥研發(fā)的熱點(diǎn)[3]。葛根素是中藥葛根最主要的活性成分之一，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其能夠有效延緩PMOP，改善機(jī)體骨量丟失[4-5]。葛根素的分子結(jié)構(gòu)與雌激素相似，能夠與破骨細(xì)胞上的雌激素受體結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟，影響骨吸收的過程[6-7]。然而，目前葛根素抗PMOP的分子靶點(diǎn)及相關(guān)的信號(hào)通路尚不清楚。雌激素缺乏導(dǎo)致成骨-破骨耦聯(lián)失衡是PMOP重要的發(fā)病機(jī)制[8-9]。其中，核因子κB受體活化因子（receptor activator ofnuclear factor kappa-B ligand，RANKL）/核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator ofnuclear factor kappa-B,RANK）/骨保護(hù)素（osteoprotegerin,OPG）信號(hào)通路參與并調(diào)控破骨細(xì)胞的骨吸收功能，與PMOP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)通過葛根素干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型，驗(yàn)證葛根素防治PMOP的療效，并進(jìn)一步探討其對(duì)破骨細(xì)胞和RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性12周齡C57BL/6小鼠30只，體重（24±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物、試劑及儀器 戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，批號(hào)：921019）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1110）；固綠染液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G2551）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，Trap）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1492）；核酸檢測(cè)試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：9534）；β-Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽（β-cross-linked C-terminal telopeptide of type I collagen，β-CTX）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H287）；抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，Trap5b）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H377-1-1）；骨形態(tài)計(jì)量?jī)x（美國(guó)Osteometrics公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Termor公司）；蔡司顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro computed tomography，Micro-CT）儀（型號(hào)：Skyscan 1170，比利時(shí) Bruker公司）。

1.3 小鼠造模及分組藥物干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只小鼠分為假手術(shù)組、模型組和葛根素治療組，每組10只。小鼠接受0.3%戊巴比妥（0.1 ml/10 g）腹腔注射麻醉后，常規(guī)剃毛消毒。于背部正中線作長(zhǎng)約1.5 cm的切口，沿背部肋弓緣、腰椎旁逐層進(jìn)入腹腔，暴露兩側(cè)卵巢及輸卵管。模型組和葛根素治療組小鼠切除雙側(cè)卵巢并結(jié)扎輸卵管，假手術(shù)組小鼠去除卵巢周圍等量的脂肪組織。檢查無活動(dòng)性出血，逐層縫合傷口。術(shù)后連續(xù)2 d腹腔注射青霉素。第3天起開始藥物干預(yù)。根據(jù)成人與小鼠的體表面積藥物換算比例，葛根素治療組小鼠予100 mg/kg劑量的葛根素（溶于0.4 ml 0.9%氯化鈉溶液）灌胃干預(yù)，隔天1次，持續(xù)8周。模型組小鼠給予0.4 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，隔天1次，持續(xù)8周。假手術(shù)組小鼠不作處理。

1.4 Micro-CT檢測(cè) 造模8周后，獲取各組小鼠右側(cè)股骨組織，剔除周圍的肌肉和韌帶。將樣本放置于Micro-CT儀內(nèi)，進(jìn)行掃描及圖像重構(gòu)。具體檢測(cè)參數(shù)如下：骨密度（BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）和骨小梁間距（Tb.Sp）。

1.5 血清β-CTX和Trap5b水平檢測(cè) 采用ELISA法。造模8周后，摘除小鼠眼球取全血約0.8 ml。靜置2 h后，4℃1 500 r/min離心30 min，取上清液0.4 ml。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清β-CTX和Trap5b水平。

1.6 Trap染色及定量分析 掃描完畢后，將股骨組織置于4%多聚甲醛中固定48～72 h。隨后將樣本進(jìn)行脫鈣、脫水及石蠟包埋處理，制作成3μm厚的石蠟切片。完成脫蠟復(fù)水后，按照Trap染色試劑盒操作手冊(cè)，先后將切片置于Trap孵育液反應(yīng)60 min和甲基綠染液染色3 min。純水清洗，95%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，透明樹脂封片。使用骨形態(tài)計(jì)量?jī)x對(duì)破骨細(xì)胞數(shù)量和骨小梁面積分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量分析。

1.7 3組小鼠股骨組織RANKL和OPG mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。獲取小鼠左側(cè)股骨，PBS反復(fù)清洗3遍，采用Trizol法萃取總mRNA。根據(jù)核酸檢測(cè)試劑盒操作手冊(cè)，獲取建立10μl反應(yīng)體系，并置于PCR儀中進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。RANKL上游引物：5'-CCTGAGACTCCATGAAAACGC-3'， 下 游 引 物 ：5'-TAACCCTTAGTTTTCCGTTGC-3'；OPG 上 游 引 物 ：5'-TCCTGCCACCTACCTAAAACAGCA-3'，下游引物：5'-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3'。循環(huán)參數(shù)設(shè)置：預(yù)變性95℃ 5 min，變性 95℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s；循環(huán)33次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠Micro-CT骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠BMD、BV/TV、Tb.N均減少，Tb.Sp增寬，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；葛根素治療組Tb.N減少，Tb.Sp增寬，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，葛根素治療組小鼠BMD、BV/TV、Tb.N均增加，Tb.Sp變窄，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 1。

表1 3組小鼠Micro-CT骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)結(jié)果比較

2.2 3組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素治療組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 3組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平比較

2.3 3組小鼠Trap染色及骨組織形態(tài)定量分析結(jié)果比較 Trap染色結(jié)果顯示：模型組小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、紊亂，部分骨質(zhì)斷裂，破骨細(xì)胞數(shù)量增加；葛根素治療組小鼠骨小梁增粗變壯，破骨細(xì)胞數(shù)量減少，見圖1（插頁(yè)）。骨組織形態(tài)定量分析結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨小梁面積分?jǐn)?shù)減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素治療組小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨小梁面積分?jǐn)?shù)變大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 3組小鼠骨組織形態(tài)定量分析結(jié)果比較

圖1 3組小鼠股骨病理檢查所見[a：假手術(shù)組；b：模型組；c：葛根素治療組；破骨細(xì)胞呈現(xiàn)紅色（由黑色箭頭標(biāo)記），骨小梁呈現(xiàn)綠色；抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）染色，×100]

2.4 3組小鼠股骨組織RANKL和OPG mRNA表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠股骨組織RANKL mRNA表達(dá)水平升高，OPG mRNA表達(dá)水平、OPG/RANKL比值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素治療組小鼠股骨組織RANKL mRNA表達(dá)水平降低，OPG mRNA表達(dá)水平、OPG/RANKL比值均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 3組小鼠股骨組織RANKL和OPG mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

骨骼是一類動(dòng)態(tài)的活性組織，即成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收時(shí)刻處于動(dòng)態(tài)平衡，使骨組織不斷更新，以維持骨骼的強(qiáng)度和彈性[11]。雌激素缺乏會(huì)持續(xù)激活破骨細(xì)胞，打破成骨-破骨耦聯(lián)平衡，使骨的吸收遠(yuǎn)大于骨的形成，最終導(dǎo)致PMOP的發(fā)生、發(fā)展。

RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路在破骨細(xì)胞活化及骨吸收中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12]。RANKL與破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合，促進(jìn)其分化、成熟和活化，并抑制其凋亡。OPG可競(jìng)爭(zhēng)性阻止RANKL與RANK的結(jié)合，起負(fù)調(diào)節(jié)作用，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。OPG/RANKL比值能夠有效地反映骨重建過程中破骨細(xì)胞的骨吸收功能，是評(píng)估成骨-破骨耦聯(lián)平衡重要的依據(jù)[13]。研究表明敲除RANKL基因或過表達(dá)OPG基因，會(huì)抑制骨的吸收，顯著增強(qiáng)機(jī)體骨量[14-15]。因此，RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路是防治PMOP重要的分子靶點(diǎn)。

葛根素是中藥葛根主要的成分，其分子結(jié)構(gòu)與雌激素相似，具有雌激素樣活性，能夠提高機(jī)體的BMD和骨量。但與雌激素不同，葛根素不會(huì)增加乳腺癌、子宮癌等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，具有成為理想抗PMOP藥物的潛力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葛根素通過調(diào)控RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路，可影響破骨前體細(xì)胞的增殖、分化和成熟[5，16]。由此提示，葛根素能夠有效緩解PMOP極有可能是通過作用于RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的骨細(xì)胞功能實(shí)現(xiàn)的。

本研究應(yīng)用成熟的去卵巢小鼠模型來模擬婦女PMOP的生理狀態(tài)。Micro-CT結(jié)果顯示：模型組小鼠BMD下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞明顯，提示PMOP小鼠模型成功建立。葛根素能夠有效減少去卵巢小鼠骨量丟失，緩解PMOP的進(jìn)展。血清ELISA結(jié)果顯示：模型組小鼠血清中β-CTX和Trap5b水平增加，提示骨吸收增強(qiáng)；葛根素能夠有效降低去卵巢小鼠β-CTX和Trap5b水平，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。Trap染色結(jié)果顯示：造模組小鼠存在大量的破骨細(xì)胞，骨小梁稀疏、破壞；葛根素治療后，破骨細(xì)胞的數(shù)量減少，骨小梁變壯增粗。上述結(jié)果提示：葛根素治療去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松可能是通過抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過程實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步qRTPCR結(jié)果顯示：去卵巢造模后，小鼠股骨RANKL mRNA表達(dá)水平升高，OPG mRNA表達(dá)水平、OPG/RANKL比值降低，可導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量增加、活性增強(qiáng)。葛根素能夠促進(jìn)OPG表達(dá)，降低RANKL表達(dá)，改善OPG/RANKL比值，抑制破骨細(xì)胞的形成和吸收功能。

綜上所述，葛根素可以促進(jìn)骨組織中OPG表達(dá)，抑制RANKL表達(dá)，降低OPG/RANKL比值，從而抑制破骨細(xì)胞的功能，防治去卵巢小鼠骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)破壞。但本研究尚存在若干不足：（1）本研究未通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步明確葛根素對(duì)破骨細(xì)胞的體外分化及活性的影響；（2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中未增設(shè)高、中、低劑量組來明確葛根素的最佳藥物濃度；（3）整個(gè)實(shí)驗(yàn)主要從骨吸收角度研究葛根素抗骨質(zhì)疏松療效及作用機(jī)制，缺少其對(duì)成骨細(xì)胞及骨形成影響的論述。