黎 少 梁永康 馮思樺 彭 青 高 毅

支原體污染是細胞培養(yǎng)、基礎(chǔ)研究和生物制品生產(chǎn)等主要問題[1-3]。雖然細胞培養(yǎng)物的支原體感染可能持續(xù)很長時間且沒有顯著的細胞損傷，不像其他細菌或真菌污染的明顯可見性，但是卻對細胞的代謝、增殖、活性等具有明顯影響，影響相關(guān)實驗結(jié)果的準確性[4-5]。支原體陽性細胞培養(yǎng)本身就是感染的主要來源，為了防止污染物擴散通常建議將陽性培養(yǎng)物丟棄并替換。如果認為培養(yǎng)物不可替代或丟棄，則需要采取可有效消除支原體污染的技術(shù)方法。近年來，已經(jīng)采用了許多方法，包括抗生素使用、裸鼠體內(nèi)傳代或者軟瓊脂中培養(yǎng)等技術(shù)[6-7]。去除支原體污染較為費時，且具有污染復(fù)發(fā)的風(fēng)險。因此，在去除支原體污染的過程中，使用方法應(yīng)操作簡便，對細胞生長的影響較小，且能保證細胞主要特征不丟失[8]。

抗生素處理已被證明是可靠、有效的方法之一，具有成本低、易操作、可控制等優(yōu)點[9-10]。當前最常用于支原體清除的抗生素有四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和酰胺醇類等，這些抗生素?zé)o論在臨床應(yīng)用和實驗研究中均具有對抗支原體的效果[11-12]。不同類型的抗生素聯(lián)合用藥可能產(chǎn)生協(xié)同或增效作用，并有助于緩解抗生素耐藥性的發(fā)生。因此，采用抗生素聯(lián)合用藥可能會提升支原體去除效果，同時抵抗支原體抗性的發(fā)展[13-14]。市場上也有許多清除支原體商品化試劑包括：BM-Cyclin(Roche)和Plasmocin(InvivoGen)等，都含有不同類別抗生素藥物。BM-Cyclin含有泰妙菌素和米諾環(huán)素兩種抗生素組合[8]。Plasmocin包含大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類等抗生素藥物[15]。上述試劑都是含有2種以上抗生素藥物類型?；诖?，我們通過已有文獻報道，設(shè)計了一種新的抗生素聯(lián)合藥物處理方案，包含了紅霉素、氯霉素、泰樂菌素和環(huán)丙沙星，成分清晰且作用機制明確。紅霉素和泰樂菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，氯霉素屬于酰胺醇類抗生素，作用機制是通過核糖體50S亞基上的23S rRNA結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成作用來發(fā)揮活性，干擾蛋白質(zhì)合成；環(huán)丙沙星屬于喹諾酮類抗菌藥物，作用于支原體DNA復(fù)制關(guān)鍵酶，阻止DNA復(fù)制和修復(fù)等[16-18]。通過蛋白合成和DNA復(fù)制等不同作用機制，聯(lián)合有效處理支原體污染，評價支原體清除后細胞功能情況，以此獲得一種成分清晰，去除支原體效果佳的抗生素聯(lián)合藥物方案。

1 材料與方法

1.1 材料

紅霉素、氯霉素、泰樂菌素購自上海陶素生化科技有限公司；Plasmocin購自 InvivoGen公司；乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液購自廣州南新制藥有限公司；PCR引物合成于北京擎科生物科技有限公司；Premix Taq TM mix購自TaKaRa公司；DEPC水購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；支原體熒光檢測試劑盒和總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；DNA marker，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和預(yù)混型qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和血清購自Gibco公司；SYBR Safe DNA Gel Stain和CCK8試劑購自ApexBio公司；瓊脂粉購自Biowest 公司；二甲基亞砜DMSO購自MP Biomedicals 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱和酶標儀購自Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀和qPCR儀購自BIO-RAD公司；熒光顯微鏡購自Zeiss公司；倒置顯微鏡購自廣州市明美光電技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和藥物配制 C3A細胞為本實驗室已有細胞，受到支原體感染，使用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。紅霉素、氯霉素、泰樂菌素分別用DMSO溶解，使用前按照比例配制成相應(yīng)濃度，環(huán)丙沙星依照1 ∶500比例添加，配制兩組濃度的抗生素聯(lián)合用藥方案：A組(Group A)，紅霉素、氯霉素、泰樂菌素終濃度分別為20 μm，環(huán)丙沙星終濃度為4 μg/mL；B組(Group B)，紅霉素、氯霉素、泰樂菌素終濃度分別為40 μm，環(huán)丙沙星終濃度為4 μg/mL。Plasmocin作為陽性對照藥物，根據(jù)說明書按照1 ∶500比例進行稀釋使用，形成終濃度50 μg/mL。對照組為含有DMSO的10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基。每兩天更換新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)12天。

1.2.2 PCR支原體檢測 引物上游序列5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’，下游序列5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’[19]。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：mix 10 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板細胞上清5 μL，DEPC水6 μL。反應(yīng)條件：98 ℃2 min，98 ℃15 s，58 ℃ 15 s，68 ℃ 20 s，30次循環(huán)，68 ℃ 5 min，4 ℃保存。取8～10 μL 體積的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗(2%)。

1.2.3 CCK8檢測 取對數(shù)生長期C3A細胞以0.5×104個/孔數(shù)量接種于96孔細胞培養(yǎng)板，抗生素聯(lián)合用藥方案處理培養(yǎng)12 d。吸去培養(yǎng)基，每孔分別加入培養(yǎng)基和CCK8試劑的混合液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，運行酶標儀并立即在450 nm處進行測量分析。

1.2.4 支原體熒光檢測 抗生素藥物處理后，首先棄掉細胞上清，再加入1 mL的細胞固定液，靜置20 min，將固定液換取，加入1 mL的Hoechst 33258工作液(覆蓋細胞)，室溫靜置20～30 min。吸掉工作液后，加入去離子水洗滌3次，直接風(fēng)干，即可在熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 qPCR檢測 使用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR。引物序列見表1，以GAPDH基因為內(nèi)參。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40次循環(huán)，溶解曲線。

表1 引物序列表

1.2.6 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 7軟件(GraphPad Software Inc)進行數(shù)據(jù)處理分析，組間分析采用t檢驗，P<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)差異，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 新的抗生素聯(lián)合用藥方案對細胞形態(tài)和活率的影響

通過前期研究分析，選取了四種針對支原體去除的抗生素藥物：紅霉素、氯霉素、泰樂菌素和環(huán)丙沙星，組合成為新的抗生素聯(lián)合用藥方案，同時以Plasmocin作為陽性對照藥物。連續(xù)12 d加藥培養(yǎng)支原體污染的C3A細胞，對照組細胞顯示出，胞內(nèi)顆粒較多，細胞邊緣不規(guī)則，形態(tài)不飽滿透亮等特征；B組抗生素聯(lián)合用藥方案處理后，C3A細胞出現(xiàn)胞內(nèi)顆粒顯著減少，形態(tài)規(guī)整，透亮折光度增強等特征變化?？股芈?lián)合用藥組的處理對受到支原體污染的C3A細胞形態(tài)學(xué)有明顯的改善(見圖1A)。

CCK8試劑檢測A、B組抗生素聯(lián)合用藥組和Plasmocin組細胞活率情況。檢測結(jié)果顯示，兩組抗生素聯(lián)合用藥方案細胞活率下降至：(98.97±3.567)%，(98.93±2.029)%，無統(tǒng)計學(xué)差異；而Plasmocin組活率下降至(91.48±1.111)%，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。由此可見，Plasmocin處理會對C3A細胞活率具有一定影響。而抗生素聯(lián)合用藥處理組對C3A細胞活率無明顯影響(見圖1B)。

注：A為抗生素聯(lián)合用藥處理12 d后C3A細胞形態(tài)學(xué)的觀察(x200)；B為兩組抗生素聯(lián)合用藥方案和Plasmocin處理后，細胞活率情況；1)P<0.05圖1 用藥處理支原體后C3A細胞形態(tài)學(xué)和活率變化

2.2 抗生素聯(lián)合用藥清除支原體效果評價

連續(xù)12 d加藥培養(yǎng)后，PCR檢測C3A細胞上清支原體，電泳結(jié)果顯示，紅霉素、氯霉素、泰樂菌素和環(huán)丙沙星，單獨添加到細胞培養(yǎng)中，支原體DNA陽性條帶仍然存在，去除效果未達到(見圖2A，泳道1～3，5)。但是B組抗生素聯(lián)合用藥方案在12 d時間的處理后，PCR電泳結(jié)果顯示沒有支原體DNA條帶，表明細胞上清已無支原體，可達到去除效果(見圖2A，泳道4)，Plasmocin用藥結(jié)果相同(見圖2A，泳道6)。

支原體熒光染色結(jié)果表明，12 d培養(yǎng)中，對照未處理細胞，其周圍可見點狀或者串點的支原體熒光染色，支原體污染嚴重(見圖2B，白色箭頭所示)；A組抗生素聯(lián)合用藥方案仍具有部分點狀支原體熒光染色，表明該濃度不能完全清除粘附在細胞上的支原體；B組抗生素聯(lián)合用藥方案可見細胞核著色，細胞形態(tài)清晰規(guī)整，背景干凈，沒有出現(xiàn)其余點狀或者串點的支原體熒光；Plasmocin組細胞周圍和表面也沒有出現(xiàn)點狀或者串點狀的支原體熒光。熒光結(jié)果表明B組抗生素聯(lián)合用藥方案處理后，細胞周圍未見支原體殘留，可達到去除效果(見圖2B)。

2.3 抗生素聯(lián)合用藥清除支原體后，主要功能基因表達情況

使用熒光定量PCR檢測用藥清除支原體后，C3A細胞中功能標志基因：CK18、ALB、CPS1和CYP1A2表達情況。結(jié)果表明，B組抗生素聯(lián)合用藥方案的CK18、ALB、CPS1 和CYP1A2相對表達量均升高(1.399±0.057 32、1.357±0.212、4.836±0.554和2.036±0.204)；Plasmocin組只有CPS1相對表達量升高(1.343±0.138)，但是CK18、ALB和CYP1A2相對表達量下降(0.778±0.386、0.414±0.134和0.810±0.071)。因此，抗生素聯(lián)合用藥方案處理支原體后，對于C3A細胞主要功能基因表達有所提升，而Plasmocin的處理并沒有恢復(fù)細胞主要功能基因的表達(見圖3)。

注：熒光定量PCR檢測比較，抗生素聯(lián)合用藥方案B組和Plasmocin分別處理12 d后，C3A細胞功能基因CK18、ALB、CPS1 和CYP1A2 相對表達水平；1)P<0.05

3 討論

在受污染的細胞系分離出20種支原體，其中95%的污染支原體類別為：發(fā)酵支原體(M．fermentans)、口腔支原體(M．orale)、精氨酸支原體(M．a(chǎn)rginini)、豬鼻支原體(M．hyorhinis)、人型支原體和萊氏無膽甾原體(A．laidlawii)[20]。支原體感染的細胞系本身就是最重要來源污染物，在實驗室受污染的細胞，大多數(shù)培養(yǎng)物含有相同的支原體種類，存在交叉污染。最新研究表明，支原體污染對細胞產(chǎn)生副作用主要表現(xiàn)為：生長速率降低，形態(tài)變化，染色體畸變，細胞因子表達異常，影響外泌體合成，細胞膜組成的變化以及蛋白和基因的改變等[21-26]。在實驗大環(huán)境下，多種因素誘發(fā)支原體污染，除了基礎(chǔ)研究，支原體污染影響生物制品生產(chǎn)也是不容忽視[27]。

近年來較為常用的支原體去除藥物試劑包括：Plasmocin、BM-Cyclin和MycoRAZOR，都是含有2種以上抗生素藥物類型。將2種藥物Plasmocin，BM-Cyclin結(jié)合應(yīng)用，支原體去除作用更為明顯。這些應(yīng)用的原理都是基于不同抗生素用藥組合產(chǎn)生協(xié)同作用，來發(fā)揮更好的去除效果[8,10，15]。在初期研究結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)單一抗生素的處理已經(jīng)不能達到去除C3A細胞支原體效果，因此我們建立一種新的抗生素聯(lián)合用藥方案：紅霉素、氯霉素、泰樂菌素和環(huán)丙沙星組合。不同于其他商品化藥物，新的抗生素聯(lián)合用藥方案組成成分清晰，均為臨床常見抗生素藥物且作用機理不同。在12 d連續(xù)處理后可達到去除支原體的效果，同時C3A細胞表面大量異樣顆粒物得到減少，細胞形態(tài)清晰規(guī)整和培養(yǎng)背景干凈，維持良好細胞活率等效果。采用PCR檢測C3A細胞上清支原體和熒光染色支原體兩種途徑，共同評價支原體清除效果，避免檢測結(jié)果的差異性。

在觀察支原體去除結(jié)果的同時，細胞的生長和功能表達恢復(fù)情況也是評價支原體去除效果的有效證明。如果細胞營養(yǎng)和環(huán)境條件有利，支原體可以在細胞培養(yǎng)物初期感染快速生長至高滴度[28]。支原體快速生長對于細胞本體的營養(yǎng)物質(zhì)獲取和生物合成也會造成競爭性作用，進而改變細胞蛋白和基因的表達等。正是由于支原體與細胞競爭性共生的模式，新的抗生素聯(lián)合用藥方案處理后，針對C3A細胞主要功能基因CK18、ALB、CPS1 和CYP1A2檢測發(fā)現(xiàn)，這4種代表性功能基因相對表達均有快速提升，這可能是支原體的去除后，細胞的競爭性生長得到迅速改善，功能基因的表達得到一定程度恢復(fù)；而Plasmocin的處理并不能使得C3A細胞功能基因表達得到恢復(fù)，反而部分基因表達相對下降。此外，抗生素能夠影響肝細胞基因表達和調(diào)節(jié)，特別是藥物代謝和蛋白合成等基因調(diào)控通路[29]。這也提示著，抗生素藥物的適應(yīng)性應(yīng)用不能忽略其對細胞的基因表達調(diào)控的影響。

抗生素藥物不僅參與調(diào)控細胞基因表達，對細胞的生長和形態(tài)等也具有影響作用。新的抗生素聯(lián)合用藥方案處理后，C3A細胞出現(xiàn)胞內(nèi)顆粒顯著減少，形態(tài)規(guī)整，形態(tài)透亮折光度增強等形態(tài)學(xué)特征變化?？股芈?lián)合用藥處理對受到支原體污染的C3A細胞形態(tài)學(xué)有明顯的改善。雖然支原體生物學(xué)的特定特征定義了它們對抗生素的敏感性和有效性，但是頻繁使用抗生素可能引起的抗性或者細胞毒性，進而導(dǎo)致清除不徹底性，可能會掩蓋對低度支原體感染的檢測[19]。因此，我們檢測兩種抗生素聯(lián)合用藥方案濃度對細胞活率情況，發(fā)現(xiàn)細胞活率下降不明顯且沒有統(tǒng)計學(xué)差異性。這些結(jié)果提示著抗生素聯(lián)合用藥方案在合適濃度范圍內(nèi)不僅能改善支原體污染的C3A細胞形態(tài)學(xué)特征，而且對細胞的毒性影響較小。

在應(yīng)用范圍上，對于臨床治療的細胞，支原體檢測結(jié)果是放行標準之一[30]。因此支原體的救治處理更應(yīng)選擇成分清晰，具有臨床應(yīng)用背景等特點的抗生素藥物。本研究建立的抗生素聯(lián)合用藥方案，均為臨床常見抗生素藥物組成，對肺炎支原體的抗菌性具良好療效[31]。因此，新的抗生素聯(lián)合用藥方案可為臨床治療類細胞在去除支原體方面提供應(yīng)用參考。

本研究目的在于通過使用多種抗生素藥物聯(lián)合用藥，降低細胞的抗藥性和毒性產(chǎn)生，達到成功治療或根除支原體污染。雖然清除支原體的抗生素藥物是一種方便快捷的救治細胞方法，但從源頭上防止支原體仍然是最理想的措施。實驗的無菌操作、環(huán)境消毒和試劑耗材來源的規(guī)范性等，定期檢測培養(yǎng)細胞支原體的污染情況也非常關(guān)鍵；此外，建立系統(tǒng)的防治污染策略，才能使支原體污染的可能性降至最低[32-35]。另一方面，并非每種抗生素藥物處理都能完全清除處理支原體，常見藥物Plasmocin和 BM-Cyclin仍具有10%和 7%的耐藥性[36]。因此抗生素作為體外培養(yǎng)預(yù)防性和治療性使用上，仍不可忽視耐藥性的監(jiān)測。