劉元林，田曉靜,2，黃匯惠，柏家林,2，丁功濤,2，孫 娜,2，馬忠仁,2，馬占龍

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心中國(guó)-馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.臨夏市俊林清真肉制品有限責(zé)任公司,甘肅 臨夏 731100)

我國(guó)是世界上牦牛數(shù)量最多的國(guó)家，主要分布在西北地區(qū)，以散戶養(yǎng)殖方式為主[1-2]，2019年，全國(guó)屠宰牦牛約360萬(wàn)頭[3].牦牛血液是屠宰過程中產(chǎn)生的最多副產(chǎn)品之一，也是一種優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物血資源，但其有較重的血腥味、消化性和適口性差、色澤感官不佳且原料血液極難保存等因素，嚴(yán)重制約著牦牛血資源的綜合利用，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[4]等問題.畜禽血液的開發(fā)已經(jīng)運(yùn)用到食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[5-6]，如將豬血血球蛋白酶解液與氧化豬脂等原料進(jìn)行熱反應(yīng)制備豬肉香精[7]；烏雞血脫色后仍保留一定的抗血栓功能作用[8]；鴨血制備高亞鐵鰲合能力的酶解產(chǎn)物[9]；駝血制備抗氧化和降糖活性肽[10]；雞血發(fā)酵液體肥料可提高小白菜種子發(fā)芽率，降低硝酸鹽，增加Vc含量[11]等.

目前，對(duì)牦牛血資源利用已有一定研究，如將牦牛血制作益生菌發(fā)酵牦牛血腸[12]；用酶解法將牦牛血紅蛋白水解成易于吸收的小肽或氨基酸來(lái)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，如牦牛血紅蛋白粉[13]、氯化血紅素[14]及補(bǔ)血營(yíng)養(yǎng)品等[15]，從而提高生產(chǎn)產(chǎn)品的高附加值.獲得高質(zhì)量水解液成為生產(chǎn)的關(guān)鍵點(diǎn).蛋白水解方法主要有酸水解、堿水解、酶水解以及微生物發(fā)酵等[16].酸、堿水解在一定程度上降低氨基酸質(zhì)量[17]；酶水解反應(yīng)條件溫和；微生物發(fā)酵對(duì)菌要求較高，發(fā)酵細(xì)菌的培養(yǎng)過程十分漫長(zhǎng)和復(fù)雜.酶處理血液資源成為目前研究的熱點(diǎn).利用水解獲得豐富的氨基酸、肽類資源，可提高牦牛血資源利用率.

本文采用單因素試驗(yàn)研究風(fēng)味蛋白酶的水解pH、溫度、料液比、酶濃度、時(shí)間對(duì)牦牛血液蛋白水解率的影響規(guī)律，并采用五因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化水解工藝，以期為綜合利用牦牛血液資源提供技術(shù)支持，也為開發(fā)牦牛血氨基酸產(chǎn)品提供基礎(chǔ)研究.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛血采于甘肅省臨夏市俊林清真肉制品有限責(zé)任公司，經(jīng)粗濾后運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室.

L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀(日本Hitachi公司)；LGJ-100F真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；FOSS scrubber 2501福斯蛋白質(zhì)消化儀(福斯中國(guó)有限公司)；S2-Field Kit便攜式pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；L3S可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司).

風(fēng)味蛋白酶(山東隆科特酶制劑有限公司(10萬(wàn)U/g))；L-酪氨酸、福林試劑(北京索萊寶科技有限公司)；乙酸、硫酸、無(wú)水乙酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸鉀、對(duì)硝基苯酚、三氯乙酸均為分析純(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)；甲醛(36%～38%)為分析純(天津市百世化工有限公司).

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

采集的新鮮牦牛血液放入真空冷凍干燥機(jī)，在-45 ℃預(yù)凍2 h后，于0.01 Pa真空度下采用-40 ℃～25 ℃線性降溫、升溫的方法，將血液凍干成血粉(血粉得率為22.41±0.01%).過80目篩，除去毛、碎肉等雜物，自封袋封存于冰箱-4 ℃保存.

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

蛋白水解效果會(huì)受料液比、酶濃度、水解pH、水解時(shí)間、水解溫度等因素的影響.本研究以蛋白水解率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白的料液比(1︰3.0、1︰4.5、1︰6.0、1︰7.5、1︰9.0 g·mL-1)、酶濃度(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%)、水解時(shí)間(2、3、4、5、6 h)、水解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、水解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對(duì)牦牛血液蛋白水解效果的影響規(guī)律.實(shí)驗(yàn)過程中每隔30 min以1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值.

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L18(37)進(jìn)行5因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白的工藝，正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 酶活力測(cè)定

參照GB/T 23527-2009蛋白酶制劑[18]中的福林法檢測(cè)酶活，于680 nm波長(zhǎng)下測(cè)風(fēng)味蛋白酶試樣的吸光值，以酪氨酸濃度為x軸，吸光值為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸曲線為y=0.0104x-0.0072，R2=0.9987，線性結(jié)果良好.

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照GB 5009.5-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的凱氏定氮法[19]，測(cè)牦牛血粉總蛋白含量平行樣3次，以平均值計(jì)算.

1.2.6 蛋白水解率的測(cè)定

采用甲醛滴定法檢測(cè)氨基酸含量，蛋白水解率[20]計(jì)算公式如下：

DH=(N-N0)/(Nt-N0)×100

式中：DH為蛋白水解率，%；N0為未水解樣品中游離氨基酸的含量，%；N為水解液中氨基酸的含量，%；Nt為底物蛋白中的總氮的含量，%.

1.2.7 氨基酸含量的測(cè)定

樣品處理：樣品液中加入5%的5-磺基水楊酸，1 200 rpm/min離心15 min，去除蛋白后取上清液，使用全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)水解產(chǎn)物中的游離氨基酸.

色譜條件：色譜柱4.6×60 mm磺酸型陽(yáng)離子樹脂，分離柱柱溫50 ℃，反應(yīng)柱柱溫135 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(one-way-analysis of variance，one-way-ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，由SPSS V17完成.試驗(yàn)結(jié)果圖由Origin 8.0軟件(美國(guó)OriginLab公司)繪制.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結(jié)果如圖1(A)所示，當(dāng)料液比在(1︰3.0～1︰7.5) g·mL-1時(shí)，蛋白水解率不斷上升；料液比為1︰7.5 g·mL-1時(shí)，蛋白水解率最大.之后蛋白水解率隨料液比減少而降低.料液比在一定范圍內(nèi)能影響風(fēng)味蛋白酶對(duì)牦牛血液蛋白的水解率，濃度過高過低都會(huì)使水解效率降低，選取較佳料液比為1︰7.5 g·mL-1.

A:料液比；B:酶濃度；C:水解pH；D:水解時(shí)間；E:水解溫度

2.1.2 酶濃度對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結(jié)果如圖1(B)所示，隨酶濃度逐漸增加，蛋白水解率也在增大.酶濃度在0.25%～0.75%時(shí)，蛋白水解率增加趨勢(shì)較快；酶濃度在0.75%～1.25%時(shí)，蛋白水解率增加趨勢(shì)變平緩.經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，1.00%酶濃度與1.25%酶濃度的蛋白水解率差異不顯著(P≥0.05).綜合考慮蛋白水解率與成本，選取較佳酶濃度為1.00%.

2.1.3 pH對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結(jié)果如圖1(C)所示，在pH為6.0～6.5范圍內(nèi)蛋白水解率明顯上升；pH為6.5時(shí)牦牛血液蛋白水解率達(dá)到最大；之后蛋白水解率不斷下降，選取較佳pH為6.5.

2.1.4 水解時(shí)間對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結(jié)果如圖1(D)所示，隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白水解率持續(xù)增加，其中2～4 h增加趨勢(shì)較快，水解5 h與6 h的蛋白水解率差異不顯著(P≥0.05).綜合考慮蛋白水解率與時(shí)間成本，選取較佳水解時(shí)間為5 h.

2.1.5 水解溫度對(duì)風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結(jié)果如圖1(E)所示，溫度過低會(huì)降低酶活性，過高會(huì)使酶失活.隨溫度的升高蛋白水解率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)牦牛血液蛋白水解率最高，選擇較佳水解溫度為50 ℃.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以水解pH、水解溫度、料液比、酶濃度、水解時(shí)間為因素，以蛋白水解率為指標(biāo)，采用五因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，其設(shè)計(jì)見表2.

表2 正交試驗(yàn)極差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以水解pH、水解溫度、料液比、酶濃度、水解時(shí)間為因素，以蛋白水解率為指標(biāo)，采用五因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果由極差分析(表2)和方差分析(表3)可知，五個(gè)因素對(duì)牦牛血液蛋白水解的影響都存在顯著性.極差分析影響順序依次為水解pH(A)>酶濃度(D)>水解時(shí)間(E)>料液比(C)>水解溫度(B)；方差分析為水解pH(A)>酶濃度(D)>水解時(shí)間(E)>水解溫度(B)>料液比(C)，即水解pH的影響最大，為主要因素；其次是酶濃度與水解時(shí)間，水解溫度與料液比的影響較小.較佳水解工藝參數(shù)為A1B2C3D3E3，即水解pH為6.0、水解溫度50 ℃、料液比1︰9.0 g·mL-1、酶濃度1.25%、水解時(shí)間6 h，此時(shí)蛋白水解率為33.42±0.44%.

赫玉蘭等人[15]以牛血紅蛋白為原料比較不同酶的水解效果，發(fā)現(xiàn)酶種類對(duì)水解效果有顯著影響(P<0.05).韓學(xué)燕等人[21]利用中性蛋白酶水解牦牛血紅蛋白水解，在pH為7.0、溫度45 ℃、酶底物濃度比6 000 U/g、底物濃度5%、水解時(shí)間5 h條件下，蛋白水解率為31.32%.付彩霞[22]探究風(fēng)味蛋白酶水解鹿血時(shí)較佳溫度為50 ℃，最適起始pH為6.5.本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與其相近，而文獻(xiàn)[22]中先用4 500 U/g堿性蛋白酶在底物濃度8%、起始pH值8.0、反應(yīng)溫度55 ℃條件下水解鹿血1 h，接著加入1 500 U/g風(fēng)味蛋白酶水解3 h，所得的鹿血酶解產(chǎn)物的水解度為27.95%.與上述研究相比，本實(shí)驗(yàn)酶添加量高、酶解時(shí)間長(zhǎng)，水解率也稍高.為獲得更加豐富的小分子肽及游離氨基酸，江霞等人[23]在風(fēng)味蛋白酶與胰酶比例(0.96︰1)，水解溫度50.88 ℃，初始pH為8.15，底物濃度6%，水解時(shí)間6 h的條件下酶解豬血蛋白水解率為43.13%.在相近的酶解時(shí)間與酶解溫度下，復(fù)酶水解率高于單酶.為提高水解率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可考慮酶的復(fù)配工藝.

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.3 牦牛血液蛋白水解液氨基酸結(jié)果

表4 風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白氨基酸結(jié)果

為進(jìn)一步探究?jī)?yōu)化的風(fēng)味蛋白酶水解工藝對(duì)牦牛血液蛋白的水解效果，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)水解液中氨基酸的種類與含量，結(jié)果見表4.

氨基酸種類與含量在一定程度上直接決定了水解液的質(zhì)量，牦牛原血與牦牛血液蛋白水解液氨基酸結(jié)果見表4.從表4可以看出，優(yōu)化后的風(fēng)味蛋白酶水解工藝在一定程度上提高了氨基酸質(zhì)量，其中亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸、丙氨酸的含量提高較多；鳥氨酸、脯氨酸、氨基丁酸的含量提高較少；水解液中新增添了天冬氨酸與谷氨酸.牦牛原血氨基酸總量為25.52 mg/100 mL.經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解后氨基酸總量為4 454.20 mg/100 mL.蛋白水解液的氨基酸總量是牦牛原血的氨基酸總量的174倍.由此可見，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的水解工藝參數(shù)較理想.牦牛血酸水解氨基酸總量為20 051.75 mg/100 mL，氨基酸總量是風(fēng)味蛋白酶水解液的4.5倍.但高溫強(qiáng)酸的條件在一定程度上會(huì)破壞部分氨基酸，酸水解液中未檢測(cè)到氨基丁酸、鳥氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸.酶水解條件較溫和，水解液中氨基酸種類較齊全.后期對(duì)水解液的處理工藝較簡(jiǎn)單，一定程度上反映出酶水解的優(yōu)勢(shì).

3 結(jié)論

為提高牦牛血液蛋白水解率，采用單因素實(shí)驗(yàn)和五因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶水解牦牛血液蛋白工藝.單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨料液比不斷減小，蛋白水解率先上升后下降.隨酶濃度逐漸增加，蛋白水解率也增大，之后增加趨勢(shì)變平緩.當(dāng)水解pH不斷變大，蛋白水解率呈先上升后下降的規(guī)律.水解時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白水解率持續(xù)增大；水解溫度不斷升高，蛋白水解率呈現(xiàn)先上升后降低的規(guī)律.通過正交實(shí)驗(yàn)確定較佳的水解條件為A1B2C3D3E3，水解pH為6.0、水解溫度50 ℃、料液比1︰9.0 g·mL-1、酶濃度1.25%、水解時(shí)間6 h.此時(shí)蛋白水解率為33.42±0.44%，且水解液氨基酸總量是牦牛原血氨基酸總量的174倍.該方法為合理利用畜禽血液資源進(jìn)行生物產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持.