馬 華，畢文靜，張 旭

(西南大學(xué) 數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)院，重慶 400715)

0 引言

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是頭頸部最常見的癌癥.世界范圍內(nèi)，口腔癌約占全世界惡性腫瘤的3%[1-2].每年全世界估計有300萬新病例[2-3].盡管口腔癌的治療取得了長足進步，早期患者的生存率超過90%，但晚期患者的總體生存率僅為30%[4-5].患者不能早診治、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及原發(fā)灶復(fù)發(fā)是口腔鱗癌預(yù)后差及五年生存率低的主要原因[2，6].因此，早期階段癌癥預(yù)測因子的檢測顯得十分重要.

與微陣列方法相比，轉(zhuǎn)錄本的測序(RNA-Seq)數(shù)據(jù)具有多個優(yōu)勢，包括檢測體細胞突變和準確測量等位基因特異性表達能力等[7].口腔癌中最常見的細胞來源是鱗狀細胞，在口腔癌中占的比例超過90%[8].晚期階段，這些癌細胞具有高度浸潤性和轉(zhuǎn)移性.Wang等人通過分析來自GEO和癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)CXCL10、OAS2、IFIT1、CCL5、LRRK2和PLAU六個基因可作為口腔鱗狀細胞癌的生物標記或潛在治療靶標[9].Wang等人通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TGFBI過表達可促進口腔鱗狀細胞癌，并與患者不良預(yù)后有關(guān)[10].Ge等人通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析確定了七個hub基因PLAU、SERPINE1、LAMC2、ITGA5、TGFBI、FSCN1和HLF與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)[11].Liu等人研究表明,唾液LDOC1是口腔鱗狀細胞癌的性別差異生物標志物[12].然而，上述文獻中均使用微陣列芯片數(shù)據(jù)集以及采用單一的方法選擇hub基因，并且OSCC的潛在分子機制尚不清楚，有待進一步探索.

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄本的測序(RNA-Seq)數(shù)據(jù)集，使用edgeR鑒定了口腔鱗狀細胞癌組織和正常組織之間的差異表達基因,并通過STRING V11數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò).使用Cytoscape軟件對其進行可視化，采用五種拓撲分析方法確定了hub基因.CytoHubba提取了網(wǎng)絡(luò)中與hub基因相關(guān)的重要模塊.GO功能和KEGG途徑富集分析探索這些聚類模塊在OSCC發(fā)病機理中的作用.Kaplan-Meier分析評估了這些hub基因的預(yù)后價值.

1 材料和方法

1.1 材料

收集一組來自口腔鱗狀細胞癌和它配對的正常組織的表達數(shù)據(jù).此數(shù)據(jù)來自美國國家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫的GEO數(shù)據(jù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，下載文檔GSE20116_RAW.tar.該數(shù)據(jù)集包括三個腫瘤樣本和三個正常樣本.文獻[7]運用這組數(shù)據(jù)證明了腫瘤中的等位基因失衡與拷貝數(shù)突變相關(guān)，而拷貝數(shù)突變又與轉(zhuǎn)錄本豐度的變化強烈相關(guān).本研究主要通過5種拓撲分析方法取交集篩選與口腔鱗狀細胞癌相關(guān)的hub基因作為潛在的生物標志物.

1.2 方法

1.2.1 DEGs的鑒定和富集分析

使用edgeR軟件包，鑒定口腔鱗狀細胞癌組織和正常組織之間的DEGs.首先，采用TMM算法對數(shù)據(jù)進行標準化和過濾(相同基因符號的不同RefSeq轉(zhuǎn)錄本，為每個基因符號保留一個轉(zhuǎn)錄本).隨后采用負二項分布對差異表達分析進行檢驗.對于任意樣本i中的任意一個基因g，假設(shè)它符合二項式分布

Ygi=NB(MiPgi,φg)

(1)

其中Mi是樣本i中讀段總數(shù)；φg是基因g的離散度；Pgi是基因g在某個條件或分組j下的相對豐度.

篩選差異基因的標準是：將閾值設(shè)置為log2(FC)>1和p-value<0.05表示上調(diào)的差異基因，log2(FC)<-1和p-value<0.05表示下調(diào)的差異基因.使用Cytoscape中的插件Bingo來查看所有DEGs在生物過程(biological processes，BP)，分子功能(molecular functions，MF)和細胞成分(cell components，CC)的中的富集情況[13].

1.2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)與OSCC相關(guān)聚類模塊的構(gòu)建

首先，把篩選出的所有DEGs輸入到STRING V11數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò).基于PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因，通過CytoHubba插件中的5種拓撲分析方法取交集選出hub基因[14].然后，利用CytoHubba插件構(gòu)建與hub基因相關(guān)的聚類模塊.本文將其作為OSCC相關(guān)模塊.

1.2.3 GO功能和KEGG途徑富集分析

為了探索OSCC相關(guān)模塊中基因的潛在功能，使用R中的clusterProfiler程序包，enrichGO(pvalueCutoff = 0.01,qvalueCutoff = 0.01)和enrichKEGG(pvalueCutoff = 0.01,qvalueCutoff = 0.01)函數(shù)對這個模塊執(zhí)行GO功能分析和KEGG途徑富集分析.ClusterProfiler是Bioconductor的R包，可以對基因集或基因簇的功能性聚類進行統(tǒng)計分析和可視化[15].

1.2.4 生存分析

Kaplan-Meier繪圖儀數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com) 是一種在線工具，可用于評估乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等患者中基因的預(yù)后價值.該工具用于分析已鑒定的hub基因與總體生存率之間的關(guān)聯(lián)[16].計算風險比(HR)及其0.95 的置信區(qū)間.根據(jù)基因表達量的中位值將數(shù)據(jù)分為高表達組和低表達組.使用默認參數(shù)，計算每個基因高表達組和低表達組的總體生存率.若P<0.05，則說明該基因與總體生存相關(guān).

2 結(jié)果

2.1 DEGs的鑒定和富集分析

從GSE20116數(shù)據(jù)集中共鑒定了1 269個DEGs，包括331個上調(diào)和938個下調(diào)基因.這些差異基因的分布情況如圖1.灰色表示在OSCC中上調(diào)或下調(diào)的DEGs.Cytoscape的插件Bingo生成一個有向無環(huán)圖,圖2顏色深淺代表富集程度，越深富集水平越高，反之越低.

圖1 差異表達基因的火山圖

圖2 差異表達基因的富集分析

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)和OSCC相關(guān)聚類模塊的構(gòu)建

基于1 269個DEGs，構(gòu)建了具有1 194個基因節(jié)點和7 900條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3A)，其中淺灰色代表hub基因，深灰色代表差異基因.通過5種常用的計算hub基因的算法，較為準確地找到hub gene.表1是每種方法前20個重要基因的排名，然后取交集(圖3B).其中被五種算法公認的hub基因是EGF、FGF2、IGF1、ACTN2、ACTA1、VWF、PTPRC、KDR、CXCL12、PTGS2和TLR4.CytoHubba插件提取了與11個hub基因相關(guān)的重要聚類模塊.該模塊具有393個節(jié)點和3 848條邊(圖3C)，其中淺灰色代表hub基因，深灰色代表差異基因.把這個OSCC相關(guān)的模塊用于下游途徑分析.

表1 5種拓撲分析方法排名前20的基因

A：PPI網(wǎng)絡(luò)；B：5種方法取交集的韋恩圖；C：由11個hub基因調(diào)控的聚類模塊

2.3 GO功能和KEGG途徑富集分析

為了探討這個聚類模塊在OSCC發(fā)病機制中的作用,對OSCC相關(guān)模塊進行了GO功能分析和KEGG通路分析(圖4).其中圖4A是BP中排名前15的術(shù)語、4B是CC中排名前15的術(shù)語、4C是MF中排名前15的術(shù)語和4D是KEGG途徑分析中排名前15的術(shù)語.GO功能分析結(jié)果表明，855個生物過程，顯著地富集在肌肉細胞分化、細胞外結(jié)構(gòu)組織、細胞外基質(zhì)組織、肌肉組織發(fā)育等過程；70個細胞組分主要富集在收縮纖維、肌原纖維、肌動蛋白細胞骨架、肌節(jié)細胞外基質(zhì)等和52個分子功能,其中與肌動蛋白結(jié)合、肌動蛋白絲結(jié)合、細胞黏附分子結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、硫化合物結(jié)合、受體配體活性等功能顯著相關(guān).而KEGG途徑富集分析鑒定了35個KEGG途徑，其中與PI3K-Akt信號通路、ECM-受體相互作用、黏著斑和軸突傳導(dǎo)等顯著相關(guān).PI3K-Akt信號通路抑制劑LY2442可逆轉(zhuǎn)PAR-2引起的致癌作用.PAR-2可通過激活PI3K-Akt信號通路促進OSCC的生長和發(fā)展[17-19].ECM-受體相互作用和黏著斑通路等有密切的相互作用.這些相互作用有利于OSCC的增殖、運動、分化和ECM代謝，同時抑制細胞死亡、平穩(wěn)地極化生長和ECM的穩(wěn)定性[20].ECM受體相互作用和黏著斑信號通路對癌細胞有明顯的調(diào)控作用[21].

圖4 GO功能和KEGG途徑富集分析

2.4 生存分析

使用Kaplan-Meier繪圖儀數(shù)據(jù)庫，繪制了11個hub基因的預(yù)后價值(圖5).根據(jù)基因表達量的中位值將數(shù)據(jù)分為高表達組和低表達組.灰色線條代表高表達組，黑色線條代表低表達組.log-rankP<0.05，說明高低表達組的生存率有顯著差異.由圖5可以看出，EGF、FGF2、IGF1、ACTN2、VWF、PTPRC、KDR、CXCL12、PTGS2和TLR4高表達組的生存率顯著高于低表達組，說明這10個基因的低表達組伴有較差的總體生存率.而ACTA1低表達組的生存率顯著高于高表達組，說明該基因高表達組的生存率較差.綜上所述，這11個hub基因都與OSCC患者的總體生存率相關(guān)(log-rankP<0.05).

圖5 hub基因的生存分析圖

3 討論

分子遺傳學(xué)和信號通路的研究可以促進對OSCC發(fā)病機理的了解，并有助于OSCC的早期診斷.因此，鑒定OSCC的差異表達基因可能有助于早期診斷和開發(fā)有效的治療方法.

在本研究中，從OSCC數(shù)據(jù)集中總共識別出1 269個DEGs，其中331個上調(diào)和938個下調(diào)基因.基于這些DEGs構(gòu)建了一個PPI網(wǎng)絡(luò).該網(wǎng)絡(luò)由1 194個基因和7 900個邊組成.然后，通過5種拓撲分析方法取交集選擇了11個hub基因.CytoHubba提取了與11個hub基因相關(guān)的聚類模塊.為了探索該聚類模塊在OSCC發(fā)病機理中的作用，對該模塊進行了GO功能和KEGG途徑分析.發(fā)現(xiàn)該模塊中的基因富含多種功能和途徑，其中PI3K-Akt信號通路、ECM-受體相互作用、細胞黏附分子(CAMs)和人乳頭瘤病毒感染等與OSCC顯著相關(guān).Kaplan-Meier分析顯示11個hub基因與OSCC患者的整體生存有關(guān).

這項研究的總體目標是確定可以作為OSCC診斷和治療的潛在生物標記的hub基因，并通過綜合分析進一步探索OSCC的潛在機制.在文獻研究的基礎(chǔ)上，從生物學(xué)角度揭示了11個hub基因都與癌癥相關(guān).其中相關(guān)文獻已經(jīng)證實了有5個hub基因在OSCC中具有重要作用，6個hub基因與其他癌癥和疾病密切相關(guān).Chen等人研究表明，miR-23a-3p可能通過靶向FGF2抑制腫瘤的增殖、侵襲并促進OSCC的凋亡[22].Zhao等人研究表明,隨著啟動子甲基化率的升高，ACTN2，ACTA1在OSCC中的表達降低[23].Tand等人研究表明，VWF被用作內(nèi)皮細胞標記，這種蛋白質(zhì)是由內(nèi)皮細胞合成的，在止血中起著重要作用，促進了第一批血小板與血管內(nèi)皮下細胞的黏附[24].Zhang等人發(fā)現(xiàn),CXCL12與FoxP3 +腫瘤浸潤淋巴細胞相關(guān)，并影響OSCC患者的生存[25].Ikebe等人發(fā)現(xiàn)，TLR4增強了胰腺癌細胞的侵襲能力并促進了胰腺癌的進程[26].Li等人研究表明了miR-26b與PTGS2相互作用，抑制PTGS2蛋白表達.此外，PTGS2表達抑制細胞增殖[27].Takahashi等人研究表明,血管內(nèi)皮生長因子及其受體KDR的表達與人結(jié)腸癌的血管形成、轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)[28].Kong等人研究表明，表面活性物質(zhì)(EPR)降低OSCC表皮生長因子(EGF)受體表達[29].Jacobsen等人研究表明,PTPRC的突變與某些家系中多發(fā)性硬化癥的發(fā)展有關(guān)[30].Cheng等人研究表明，IGF1遺傳變異與前列腺癌的發(fā)病風險相關(guān)聯(lián)[31].

4 結(jié)論

針對以往篩選hub基因方法單一的問題，提出一種可以綜合考慮各種方法來精確篩選hub基因的新思路.本文主要通過5種拓撲分析方法，確定了11個hub基因，包括EGF、FGF2、IGF1、ACTN2、ACTA1、VWF、PTPRC、KDR、CXCL12、PTGS2和TLR4.通過途徑分析、相關(guān)文獻和kaplan-meier分析驗證了這些hub基因.結(jié)果表明，這11個hub基因可以作為OSCC的潛在預(yù)后生物標志物和治療靶標.盡管對本研究結(jié)果需要進一步的生物學(xué)驗證，但本研究為探索潛在的生物標志物和OSCC相關(guān)的診斷、預(yù)后和治療靶標提供了新的思路.