高楚楚 王三南 付 凱 趙醒醒 楊祖銘 馮宗太

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院（蘇州市立醫(yī)院）新生兒科（江蘇蘇州 215002）

新生兒敗血癥是新生兒期感染致死的主要原因，其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，不同致病菌引起的臨床表現(xiàn)難以鑒別，若識別和救治不及時可迅速導(dǎo)致多器官功能障礙[1]。此外，部分新生兒敗血癥幸存者可發(fā)生認(rèn)知和功能障礙，給醫(yī)療系統(tǒng)和社會造成巨大負(fù)擔(dān)[2]。因此新生兒敗血癥的早期診斷關(guān)乎其救治成敗及近遠(yuǎn)期預(yù)后。目前臨床上仍以血培養(yǎng)檢出致病菌作為新生兒敗血癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但在實際應(yīng)用中血培養(yǎng)存在出結(jié)果時間長、敏感性低的問題，而一些傳統(tǒng)的非特異性指標(biāo)如白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell count，WBC）、血小板計數(shù)（platelet count，PLT）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）等的早期靈敏度與特異度也不甚理想，使其早期診治受到限制[3]。程序性壞死作為細(xì)胞的一種死亡方式，近年來已成為研究的熱點，越來越多的證據(jù)表明其參與多種疾病狀態(tài)下炎癥反應(yīng)的激活[4]。本研究通過前瞻性研究程序性壞死的關(guān)鍵因子受體相互作用蛋白3（receptor interacting protein 3，RIP3）在新生兒敗血癥中的表達情況，并與CRP、PLT進行比較，旨在探究其對新生兒敗血癥早期診斷的臨床價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

以2019年9月至2020年5月蘇州市立醫(yī)院本部新生兒科收治的72 例新生兒為研究對象。敗血癥組納入標(biāo)準(zhǔn)：①起病日齡＜28 d；②未用抗菌藥物時即行血常規(guī)、CRP、血培養(yǎng)等指標(biāo)的檢測；③經(jīng)治療后痊愈或好轉(zhuǎn)出院。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①與敗血癥組同期入院；②起病日齡＜28 d；③非感染性疾?。ň鶡o感染癥狀且臨床感染性指標(biāo)陰性），包括母重度子癇或精神異常剖宮產(chǎn)早產(chǎn)兒、低血糖及母乳性黃疸患兒等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①起病日齡≥28 d；②存在窒息、先天性畸形、遺傳代謝病或免疫缺陷病等；③住院期間放棄治療或死亡。

本研究獲得蘇州市立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，均獲得研究對象法定監(jiān)護人知情同意。

新生兒敗血癥以中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會新生兒學(xué)組2019 年制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)作參照[5]。確診：在臨床異常表現(xiàn)的前提下，血培養(yǎng)或腦脊液培養(yǎng)檢出致病菌。臨床診斷：在臨床異常表現(xiàn)的前提下，滿足以下條件中任意1項：①血液非特異性檢查≥2項陽性；②腦脊液檢查異常；③血中檢出致病菌DNA。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集兩組患兒一般情況，包括性別、胎齡、出生體質(zhì)量、采樣日齡等信息。

1.2.2 血液標(biāo)本采集 敗血癥組在未用抗菌藥物前采集患兒平臥位股靜脈或橈動脈血3 mL，取1 mL注入兒童血培養(yǎng)瓶（BD BACTEC Peds Plus/F），1 mL注入?yún)捬跹囵B(yǎng)瓶（BD BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F）行血培養(yǎng)；余1 mL 注入EDTA 抗凝管，行CRP、PCT檢測后，再以離心力1 610×g離心10 min，吸取上清50～100 μL至1.5 mL無菌EP管并分裝，進行標(biāo)記，保存于-80℃冰箱以備檢測RIP3。在治療后（有效抗菌藥物治療7～10 d）以相同方法采集股靜脈或橈動脈血1 mL 行CRP 和PLT 測定，然后分離血漿后保存待測RIP3。對照組以同樣方法采集1 mL血標(biāo)本檢測CRP、PLT和RIP3。

1.2.3 致病菌培養(yǎng) 敗血癥組血培養(yǎng)采用美國BD BACTEC FX200全自動血培養(yǎng)儀，由蘇州市立醫(yī)院本部細(xì)菌實驗室專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.4 CRP、PLT 測定 CRP 采用免疫比濁法檢測，所用器材為杭州中翰盛泰全自動樣品處理系統(tǒng)及配套試劑；PLT 采用全自動血液分析儀（日本希森美康血液細(xì)胞分析儀）檢測。二者均嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.5 RIP3測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測，所用儀器為瑞士TECAN Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀，試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司，嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0和Medcalc 19.5.3統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制所有受試者血漿RIP3的工作特征曲線（ROC）并確定最佳截斷值，分析RIP3、CRP和PLT單獨檢測及聯(lián)合檢測對新生兒敗血癥診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

36例敗血癥新生兒納入研究，男25例、女11例，胎齡27～40周，出生體質(zhì)量750～3 600 g，日齡1～27 d。對照組36例中男25例、女11例，胎齡27～40周，出生體質(zhì)量600～3 900 g，日齡1～26 d。兩組患兒在性別、胎齡、出生體質(zhì)量、日齡方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

敗血癥組血培養(yǎng)檢出致病菌24例，其中1例為兩種菌株生長，其余23例均為單種菌株生長（表2）。

2.2 各組RIP3、CRP和PLT水平比較

敗血癥組治療前、后與對照組RIP 3、CRP 和PLT差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。敗血癥組治療前RIP 3、CRP 高于治療后和對照組，PLT 低于治療后和對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。敗血癥組治療后RIP3、CRP和PLT與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 RIP3、CRP和PLT對新生兒敗血癥的預(yù)測價值

RIP 3、CRP 和PLT 預(yù)測新生兒敗血癥曲線下面積（AUC）分別為88.8%、84.5%和62.4%（圖1）。RIP3≥15.91 ng/mL或CRP＞8 mg/L或PLT＜100×109/L時，預(yù)測新生兒敗血癥的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測值見表4。

2.4 多項指標(biāo)聯(lián)合檢測對新生兒敗血癥的預(yù)測價值

ROC 曲線分析顯示，RIP 3+CRP+PLT、RIP 3+CRP、RIP 3+PLT、CRP+PLT 聯(lián)合檢測預(yù)測新生兒敗血癥的AUC分別為93.9%、93.7%、88.7%和85.0%（圖2）。四種聯(lián)合檢測方法對新生兒敗血癥診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值見表5。

圖1 治療前RIP3、CRP 和PLT 對預(yù)測新生兒敗血癥ROC曲線

表3 敗血癥組治療前、后與對照組各指標(biāo)比較

表4 治療前各指標(biāo)對新生兒敗血癥的預(yù)測價值（%）

表5 多項指標(biāo)聯(lián)合對新生兒敗血癥的預(yù)測價值（%）

圖2 多項指標(biāo)聯(lián)合診斷新生兒敗血癥ROC 曲線

3 討論

在病理狀態(tài)下，機體可通過細(xì)胞凋亡維持穩(wěn)態(tài)，但細(xì)胞凋亡通常被認(rèn)為是非炎癥性的生物學(xué)過程，當(dāng)這一過程受到抑制時，壞死可作為使細(xì)胞死亡的一種替代性路徑被激活，參與機體的一系列炎癥反應(yīng)[6]。研究表明，細(xì)胞是否發(fā)生凋亡或壞死主要取決于RIP1、RIP3和半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）之間的相互關(guān)系[7]。目前關(guān)于細(xì)胞壞死的機制研究主要涵蓋程序性壞死、鐵死亡、炎性壞死等通路[8]，其中程序性壞死的發(fā)生機制是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

程序性壞死是由RIP 3 和混合連接激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白介導(dǎo)的高度調(diào)控性細(xì)胞壞死，在生物或理化因素刺激下，磷酸化RIP 3 與RIP 1 相互作用，募集Fas 相關(guān)死亡域蛋白和caspase-8形成Ⅱ型復(fù)合體，激活下游程序性壞死信號通路[9]，參與感染性疾病、急性缺血再灌注損傷、惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等發(fā)病過程[10-13]。程序性壞死在全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）的調(diào)節(jié)中亦發(fā)揮重要作用。程序性壞死通路的激活引起細(xì)胞膜離子通道開放，細(xì)胞腫脹破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)容物尤其是大量細(xì)胞因子，從而引起SIRS。如RIPK3缺失可導(dǎo)致小鼠損傷相關(guān)分子模式數(shù)量的明顯下降，減輕全身炎癥反應(yīng)[14]。有研究用RIP1抑制劑Nec-1預(yù)處理小鼠得到相似結(jié)果，且發(fā)現(xiàn)Nec-1對減輕SIRS的作用呈劑量依賴性[15]。鑒于SIRS是新生兒敗血癥發(fā)病的本質(zhì)，推測程序性壞死可能與新生兒敗血癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但目前僅限于動物實驗[16-17]。

本研究顯示，敗血癥組治療前RIP 3 表達明顯高于對照組，說明血漿RIP 3 水平與新生兒敗血癥發(fā)病相關(guān)。研究顯示，在成人嚴(yán)重膿毒癥患者中，死亡患者的血漿RIP3水平高于存活出院患者，且RIP3水平與住院死亡率及器官衰竭程度呈正相關(guān)[18-19]，這間接證實RIP 3 高表達可提示疾病的不良結(jié)局。本研究也檢測到敗血癥組治療后血漿RIP 3 水平下降，提示隨著感染控制、病情好轉(zhuǎn)，RIP3表達趨于正常，推測RIP3有助于判斷新生兒敗血癥臨床療效和轉(zhuǎn)歸。

新生兒敗血癥救治成功的關(guān)鍵在于早期診斷和及時治療，生物學(xué)標(biāo)志物被廣泛使用以幫助診斷、指導(dǎo)治療及改善預(yù)后。病原學(xué)檢查特異性高，但血培養(yǎng)耗時長、敏感性低，核酸和抗原檢測對病原體不明的敗血癥患兒價值較低[20]，故在臨床工作中新生兒敗血癥的早期病情判斷有賴于WBC、PLT、CRP、PCT等非特異性感染指標(biāo)[21]。本研究同時檢測CRP、PLT以及RIP3，并評估三項指標(biāo)對新生兒敗血癥早期診斷的價值，結(jié)果顯示，CRP和PLT的靈敏性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均低于RIP 3，說明血漿RIP 3 是具備較高診斷效能的生物學(xué)標(biāo)志物，其診斷靈敏性、特異度分別為77.8%和91.7%。而RIP 3、CRP 和PLT 聯(lián)合診斷新生兒敗血癥的靈敏性、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值最高。

本研究的不足之處在于倫理學(xué)限制，臨床實踐中難以獲取生理條件下新生兒血標(biāo)本，加之納入的研究對象數(shù)量較少，缺乏生理條件下不同胎齡、不同體質(zhì)量新生兒RIP3表達情況，故還需長期、大規(guī)模的多中心臨床研究以論證。

綜上所述，檢測血漿RIP 3 水平有助于新生兒敗血癥的早期識別及臨床療效判斷。尚待進一步深入開展研究RIP 3 相關(guān)的程序性壞死通路在新生兒敗血癥發(fā)病過程中的具體調(diào)控機制，并尋找潛在干預(yù)靶點，為新生兒敗血癥的臨床救治提供新思路。