劉 洋 劉麗萍 陳紹占

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069； 2.北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100013； 3.北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心 100013)

前言

野生食用菌由于味道鮮美，富含氨基酸，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2]，成為人們餐桌上的“?？汀?。然而，有研究表明[3-4]，由于食用菌富集重金屬的能力很強(qiáng)，因而食用菌中重金屬含量超標(biāo)現(xiàn)象也屢見(jiàn)不鮮。砷是人們熟知的重金屬之一，長(zhǎng)期過(guò)量攝入會(huì)導(dǎo)致皮膚癌、肺癌等疾病，由于砷的形態(tài)很多，不同砷形態(tài)毒性不同，以砷化合物的半數(shù)致死量來(lái)計(jì)，其毒性大小依次為As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA>砷甜菜堿(AsB)，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和統(tǒng)稱(chēng)為無(wú)機(jī)砷，無(wú)機(jī)砷毒性大，是致癌物質(zhì)，而砷甜菜堿(AsB)等有機(jī)砷[5]幾乎無(wú)毒，因此目前砷仍是研究的熱點(diǎn)?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物的限量》(GB 2762—2017)中規(guī)定食用菌總砷的限量為0.5 mg/kg。隨著研究的不斷深入[6]，發(fā)現(xiàn)野生食用菌中存在不同的砷形態(tài)，為了更好地評(píng)估食用菌的安全性，新修訂的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物的限量》(GB 2762-20XX)的征求意見(jiàn)稿中，將食用菌的總砷限量修改為無(wú)機(jī)砷限量，增加了銀耳、木耳等食用菌中無(wú)機(jī)砷限量規(guī)定。

砷形態(tài)的分析檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)法[7-8]、液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS)法[9]、離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(IC-ICP-MS)法[10]、毛細(xì)管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜(CE-ICP-MS)法等。其中，高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法因其靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但因其儀器價(jià)格和運(yùn)行成本較高也限制了它的使用，液相色譜-原子熒光光譜法因價(jià)格成本較低、實(shí)用性強(qiáng)也得到廣泛使用。

本實(shí)驗(yàn)選用新型的配有氫氣發(fā)生器的液相色譜-原子熒光光譜儀分析研究食用菌中砷形態(tài)，氫氣發(fā)生器的使用極大地節(jié)約了化學(xué)試劑的用量，所提供的穩(wěn)定的氬氫火焰使得原子化效率更高，提高了檢測(cè)靈敏度，操作方便。當(dāng)不開(kāi)紫外消解燈時(shí)砷甜菜堿等有機(jī)砷不能準(zhǔn)確測(cè)定，本文主要對(duì)食用菌中亞砷酸根As(Ⅲ)、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷酸根As(Ⅴ)四種砷形態(tài)進(jìn)行分析研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

配有自動(dòng)進(jìn)樣器的Prin-Cen液相色譜儀(廣州普臨晟科技有限公司)；原子熒光光譜儀(北京寶德儀器有限公司)；Hamiton PRPX-100色譜柱及其保護(hù)柱；Milli-Q Integral超純水處理系統(tǒng)(美國(guó) Millipore公司)；新芝超聲波清洗器；高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]、硼氫化鉀(KHB4)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、氨水(NH3·H2O)、過(guò)氧化氫(H2O2)等均為分析純?cè)噭?國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；65%硝酸(德國(guó)Merck)；亞砷酸根As(Ⅲ)(GBW 08666)、一甲基砷酸(MMA，GBW 08668)、二甲基砷酸(DMA，GBW 08669)、砷酸根As(Ⅴ)(GBW 08667)、砷甜菜堿(AsB，GBW 08670)等砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 樣品前處理

1.2.1 砷形態(tài)測(cè)定前處理

稱(chēng)取食用菌試樣0.5 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)于50 mL 聚丙烯離心管中，加入20 mL硝酸(0.15 mol/L)，于60 ℃超聲水浴中提取1 h，取出冷卻至室溫，于8 000 r/min離心10 min，吸取上層清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。按同一操作方法做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 總砷測(cè)定前處理

采用 GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》中電感耦合等離子體質(zhì)譜法，稱(chēng)取0.3 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)樣品于微波消解罐中，加入6 mL濃硝酸和1 mL過(guò)氧化氫放置1 h，按相關(guān)操作步驟進(jìn)行消解，冷卻后，定容至25 mL，上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器工作參數(shù)

各儀器最佳工作參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 LC-AFS儀器參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

陰離子交換色譜柱是目前用于砷形態(tài)分析最為廣泛的色譜柱，常用的陰離子交換色譜柱有Hamilton PRPX-100、Dionex Ion Pac AS19等。其中，Hamilton PRPX-100[11-12]適用的pH值范圍較廣，在pH值為1～13范圍內(nèi)均適用，分離效果好，普適性強(qiáng)，價(jià)格適宜，出峰時(shí)間穩(wěn)定，樣品的前處理選用0.15 mol/L的硝酸提取時(shí)，其溶液呈酸性，此色譜柱較適宜，AS19色譜柱在酸性條件下，柱效會(huì)受到一定的影響，影響使用壽命，且價(jià)格較昂貴。因而本實(shí)驗(yàn)選用Hamilton PRPX-100色譜柱。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

由于食用菌中存在A(yíng)sB等有機(jī)砷，需采用梯度洗脫進(jìn)行砷形態(tài)的有效分離，液相色譜-原子熒光光譜法常用的分離體系A(chǔ)：1 mmol/L (NH4)2HPO4(pH=9)，B：20 mmol/L (NH4)2HPO4,對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，由于通常情況中As(Ⅴ)的靈敏度較低，對(duì)流動(dòng)相B進(jìn)行優(yōu)化，分別配制(20、25、30 mmol/L)的 (NH4)2HPO4，通過(guò)測(cè)定1 mg/L AsB和10 μg/L的As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(Ⅴ)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，不同濃度的流動(dòng)相所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值如圖1所示，隨著流動(dòng)相濃度的增加，As(Ⅴ)的信號(hào)響應(yīng)值逐漸增加且出峰時(shí)間逐漸縮短，當(dāng)采用30 mmol/L時(shí)，信號(hào)響應(yīng)值和出峰時(shí)間均較好，因此，選擇流動(dòng)相B選擇30 mmol/L(NH4)2HPO4為宜。

2.3 樣品提取條件的優(yōu)化

本次實(shí)驗(yàn)選用總砷含量較高的姬松茸進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了硝酸(0.15 mol/L) 60 ℃超聲1 h、100 ℃微波輔助提取和90 ℃熱浸提1 h三種不同的提取方法對(duì)砷形態(tài)的提取效果，如圖2可知，采用硝酸(0.15 mol/L) 60 ℃超聲1 h方式提取砷效果較好，且方法簡(jiǎn)單便于操作，測(cè)定結(jié)果表明此樣品不含有DMA 。

圖1 不同濃度流動(dòng)相B的砷形態(tài)分離色譜圖Figure 1 The separation chromatogram of arsenic species in different concentration mobile phase B.

圖2 不同提取方法對(duì)于砷形態(tài)的影響Figure 2 Effects of different extraction methods on arsenic species.

2.4 氫氣發(fā)生器氫氣輸出流量的考察

實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)氫氣發(fā)生器的使用，使得原子熒光光譜法所用還原劑和載流的使用量大大減少，當(dāng)開(kāi)機(jī)測(cè)定砷形態(tài)6 h以上時(shí)較傳統(tǒng)LC-AFS儀器的還原劑和載流的使用量約減少2倍，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在不同的氫氣輸出流量下，四種砷形態(tài)的靈敏度不同，為了探究氫氣的最佳輸出流量，配制濃度為10.0 μg/L的As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(V)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳儀器狀態(tài)下考察，發(fā)現(xiàn)隨著氫氣輸出流量的增加(見(jiàn)圖3)，信號(hào)強(qiáng)度增加，當(dāng)增加到110 mL/min時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到了一個(gè)較優(yōu)值，當(dāng)流量大于110 mL/min后，信號(hào)強(qiáng)度緩慢下降，且當(dāng)氫氣輸出流量過(guò)大時(shí)，會(huì)影響砷形態(tài)的測(cè)定。因此最終選用氫氣輸出流量為110 mL/min。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線(xiàn)性范圍及檢出限

通過(guò)線(xiàn)性范圍實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明本方法線(xiàn)性范圍較寬，在0～100.0 μg/L的濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.999以上，圖4為濃度10 μg/L 時(shí)4種砷形態(tài)化合物色譜圖。將As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(Ⅴ) 四種砷的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋測(cè)定方法檢出限，以3倍基線(xiàn)噪聲時(shí)砷形態(tài)的濃度為檢出限(S/N=3)，結(jié)果見(jiàn)表2，該儀器的檢出限較傳統(tǒng)LC-AFS[13]有明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖3 不同氫氣輸出流量對(duì)砷形態(tài)信號(hào)強(qiáng)度的影響Figure 3 Effects of different hydrogen output flow rates on arsenic species signal intensity.

表2 線(xiàn)性范圍及檢出限

圖4 4種砷形態(tài)色譜圖(10 μg/L)Figure 4 Chromatogram of four arsenic species(10 μg/L).

2.5.2 方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

以加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察方法準(zhǔn)確度，以精密度來(lái)考察方法的重現(xiàn)性。

2.5.2.1 模擬樣品精密度及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

選用干姬松茸、鮮杏鮑菇、銀耳不同類(lèi)別的食用菌，添加三個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率在80.2%～106%。平行制備6個(gè)模擬樣品進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RSD值均小于5%，結(jié)果見(jiàn)表3、4、5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.2.2 實(shí)際樣品的精密度

選取砷含量較高的有機(jī)元蘑和牛肝菌進(jìn)行方法精密度的測(cè)定，制備6個(gè)平行樣品，測(cè)定其砷形態(tài)含量，分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表6所示，RSD值均小于5%。

2.6 實(shí)際樣品分析

采集市售食用菌樣品，根據(jù)GB 5009.11—2014方法一測(cè)定總砷，選擇按GB 2762—2017判定總砷含量超出0.5 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)的楊樹(shù)蘑、黃蘑、紅蘑、草蘑、牛肝菌、姬松茸等樣品，采用所建方法進(jìn)行砷形態(tài)測(cè)定，分析結(jié)果見(jiàn)表7，其中編號(hào)10的野生食用菌總砷含量高達(dá)26.6 mg/kg，測(cè)定其砷形態(tài)如圖5所示，在未開(kāi)紫外消解燈的情況下，其有機(jī)砷AsB含量仍然較高，無(wú)機(jī)砷含量相對(duì)較低，而編號(hào)為11的有機(jī)元蘑中無(wú)機(jī)砷含量高達(dá)1.76 mg/kg，實(shí)驗(yàn)表明總砷含量高的食用菌(圖6)，并不意味具有食品安全問(wèn)題，快速準(zhǔn)確測(cè)定食用菌中無(wú)機(jī)砷非常重要。

表3 姬松茸加標(biāo)回收率和精密度

表4 銀耳加標(biāo)回收率和精密度

表5 鮮杏鮑菇加標(biāo)回收率和精密度

表6 實(shí)際樣品精密度測(cè)定結(jié)果

表7 食用菌四種砷形態(tài)含量

圖5 編號(hào)10的野生食用菌砷形態(tài)色譜圖 Figure 5 Chromatogram of arsenic speciations in wild edible No.10.

圖6 編號(hào)11的有機(jī)元蘑砷形態(tài)色譜圖Figure 6 Chromatogram of arsenic speciations of organic mushroom No.11.

3 結(jié)論

建立了液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定食用菌中砷形態(tài)的方法，在未開(kāi)紫外消解燈的情況下可以準(zhǔn)確測(cè)定食用菌中四種砷形態(tài)，使用氫氣發(fā)生器可以大大減少還原劑和載流的用量，提高無(wú)機(jī)砷測(cè)定的靈敏度。通過(guò)實(shí)際樣品測(cè)定表明，總砷含量高，并不意味無(wú)機(jī)砷含量高，不能代表其具有食品安全問(wèn)題，因此對(duì)食用菌中有害的無(wú)機(jī)砷測(cè)定非常必要，以保證食品安全。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作方便，靈敏度高，準(zhǔn)確、可靠，適用于食用菌中DMA、MMA和無(wú)機(jī)砷的測(cè)定，可為食用菌的安全評(píng)估提供技術(shù)支持，為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》(GB 5009.11—2014)方法的修訂提供保證。