冉建新 胡等慧 王曉杰

1.北京市第六醫(yī)院藥劑科，北京 100007；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；3.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京 100176

失眠又稱為睡眠障礙（sleep deprivation，SD），是指睡眠時間和質(zhì)量下降不能滿足人們?nèi)粘Ｉ鐣顒拥囊环N睡眠障礙綜合征[1]，屬中醫(yī)范疇內(nèi)“不寐”“不得眠”“不得臥”等，是目前臨床較為難治的疾病之一[2-3]。酸棗仁、五味子兩藥在中醫(yī)經(jīng)典安神方劑中多配伍使用，是臨床常用的安神藥對之一，具有滋陰養(yǎng)血、安神鎮(zhèn)驚、消除疲勞等功效，可用于各種與失眠有關(guān)的病癥，如神經(jīng)衰弱等[4-10]。北京市第六醫(yī)院（以下簡稱“我院”）臨床應(yīng)用酸棗仁-五味子混合粉末口服給藥的鎮(zhèn)靜催眠效果較為理想，與文獻(xiàn)報道相一致；但二者最佳配比，未見有相關(guān)報道[11-13]。鑒于此，選取臨床常用的酸棗仁-五味子3 個配比（15 g∶6 g、12 g∶6 g、6 g∶6 g）進行考察，篩選方便、安全、高效的半仿生提取法的提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備儀器

1.1.1 試劑

酸棗仁、五味子購買于河北安國藥材市場；戊巴比妥鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：WS20060 401）；艾司唑侖（山東信誼制藥有限公司，批號：180905）；谷氨酸（Glu，貨號：CSB-E05129r）、γ-氨基丁酸（GABA，貨號：SA8240）、谷氨酰胺（Gln，貨號：CSB-E12692h）、5-羥色胺（5-HT，貨號：CSB-E14956r）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA，貨號：CEB005Ge-2），上述酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.2 設(shè)備儀器

VT05404-0998 全自動酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器公司）；YY/T0657-2008 高速冷凍離心機（湖南赫西儀器公司）；KQ-250E 多功能粉碎機（鉑歐五金廠）；DHG-9030A（101）電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；S1-2002 電子天平（丹佛儀器有限公司）。

1.2 實驗動物

SPF 級昆明種小鼠購于北京斯貝福實驗動物有限公司，雄性，5 周齡，體重（25±5）g，合格證號：SCXK9（京）2017-0002。實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境：SPF 級動物房，自由飲水，相對濕度：40%～70%，室溫：20～26℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸棗仁-五味子配比篩選

1.3.1.1 供試品溶液的制備 根據(jù)2015 版《中華人民共和國藥典》一部[4]規(guī)定人體臨床用量及我院常用的配比進行分析，確定制備3 份不同配比的供試品溶液，其中酸棗仁與五味子配比依次為：15 g∶6 g、12 g∶6 g、6 g∶6 g。模擬臨床使用中所采取的酸棗仁-五味子混合粉末口服的給藥形式，上述不同配比藥物打粉制備混懸液以備實驗使用。

1.3.1.2 實驗分組及給藥 依據(jù)隨機數(shù)字表法，將50 只小鼠分為空白組、陽性藥組、酸棗仁：五味子（15 g∶6 g）組、酸棗仁：五味子（12 g∶6 g）組、酸棗仁：五味子（6 g∶6 g）組，每組10 只?？瞻捉M給予蒸餾水，陽性藥組給予0.13%艾司唑侖水溶液，給藥組給予相應(yīng)配比混懸液，連續(xù)給藥14 d。

1.3.1.3 閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠 各組小鼠適應(yīng)性3 d 后，于實驗第1 天開始灌胃給予藥物，給藥60 min 后，腹腔注射閾下濃度戊巴比妥鈉，0.1 mL/10 g，觀察30 min 內(nèi)入睡小鼠只數(shù)（翻正反射消失1 min以上）。

1.3.1.4 閾劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠 試驗期間每天定時給藥，第13 天，各組小鼠灌胃給予對應(yīng)藥物60 min 后，腹腔注射閾上濃度戊巴比妥鈉，0.1 mL/10 g，計算各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間（以注射后小鼠翻正反射消失為入睡指標(biāo)，小鼠翻正反射恢復(fù)為蘇醒指標(biāo)）。

1.3.1.5 小鼠大腦內(nèi)GABA、Glu、Gln、5-HT 和5-HIAA含量檢測 試驗最后1 d，5 組小鼠給藥60 min 后注射閾劑量戊巴比妥鈉，12 h 后處死，制備10%的腦組織液，按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作，分別測定腦組織液中GABA、Glu、Gln、5-HT 和5-HIAA 含量。

1.3.2 半仿生提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面法實驗設(shè)計 將上述篩選得到的藥對配比，進行半仿生提取工藝的優(yōu)化。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，利用BBC 設(shè)計原理，選取人工胃液的用量和提取時間，人工腸液的用量和提取時間4 個為自變量為考察因素，以GABA 和5-HT 的綜合評分為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，見表1。利用Design-Expert 軟件進行響應(yīng)面分析，確定酸棗仁與五味子半仿生提取工藝的最佳條件。

表1 四因素三水平中心組合實驗因素水平編碼表

1.3.2.2 供試品溶液的制備及分組給藥 參考上述實驗，選取GABA 和5-HT 為考察指標(biāo)，設(shè)計藥效試驗，操作同上，每組5 只小鼠，將仿生提取液減壓濃縮為1 g/mL 灌胃給藥，于第14 天末次給藥60 min 后處死，制備腦組織液，測定GABA 和5-HT 含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 8.2 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁、五味子配比篩選結(jié)果

2.1.1 閾下劑量戊巴比妥鈉對各組小鼠入睡的影響

與空白組比較，陽性藥組、15 g∶6 g 組、12 g∶6 g組以及6 g∶6 g 組小鼠入睡率均有一定程度提高，其中以陽性藥組療效最佳，15 g∶6 g 組次之，12 g∶6 g 及6 g∶6 g 組效果相近。見表2。

表2 閾下催眠劑量戊巴比妥鈉對各組小鼠入睡的影響

2.1.2 閾劑量戊巴比妥鈉對各組小鼠睡眠時間的影響

與空白組比較，陽性藥組、15 g∶6 g 組以及6 g∶6 g組小鼠睡眠潛伏期明顯縮短、睡眠持續(xù)時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與陽性藥組比較，12 g∶6 g 組睡眠潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。與15 g∶6 g 組比較，12 g∶6 g 組睡眠潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 閾劑量戊巴比妥鈉對各組小鼠睡眠的影響（min，）

表3 閾劑量戊巴比妥鈉對各組小鼠睡眠的影響（min，）

注：與空白組比較，*P ＜0.05、**P ＜0.01；與陽性藥組比較，#P ＜0.05；與15 g∶6 g 組比較，△P ＜0.05

2.1.3 藥物對各組小鼠腦組織GABA、Glu及Gln含量的影響

與空白組比較，陽性藥組和15 g∶6 g 組小鼠腦內(nèi)GABA 含量增加、Glu 和Gln 含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與陽性藥組比較，12 g∶6 g 組和6 g∶6 g 組GABA 含量減少、Glu 和Gln 含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。與15 g∶6 g 組比較，12 g∶6 g 組GABA 含量減少；6 g∶6 g 組Gln 含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表4。

表4 藥物對各組小鼠腦組織中GABA、Glu 及Gln 的影響（）

表4 藥物對各組小鼠腦組織中GABA、Glu 及Gln 的影響（）

注：與空白組比較，*P ＜0.05、**P ＜0.01；與陽性藥組比較，#P ＜0.05；與15 g∶6 g 組比較，△P ＜0.05。GABA：γ-氨基丁酸；Glu：谷氨酸；Gln：谷氨酰胺

2.1.4 藥物對各組小鼠腦內(nèi)5-HT 及5-HIAA 的影響

與空白組比較，陽性藥組、15 g∶6 g 組、12 g∶6 g組和6 g∶6 g 組的5-HT 含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。與陽性藥組比較，12 g∶6 g組5-HT 含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。與15 g∶6 g 組比較，12 g∶6 g 組5-HT 含量減少，差異統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。與空白組比較，陽性藥組5-HIAA 含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。與陽性藥組比較，15 g∶6 g 組、12 g∶6 g 組、6 g∶6 g 組5-HIAA 含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表5。

表5 藥物對各組小鼠腦組織中5-HT 及5-HIAA 的影響（pg/g，）

表5 藥物對各組小鼠腦組織中5-HT 及5-HIAA 的影響（pg/g，）

注：與空白組比較：*P ＜0.05，**P ＜0.01，與陽性藥組比較：#P ＜0.05；與15 g∶6 g 組比較，△P ＜0.05。5-HT：5-羥色胺；5-HIAA：5-羥吲哚乙酸

綜上所知，酸棗仁與五味子不同配比均能對小鼠起到一定的鎮(zhèn)靜催眠作用，其中以15 g∶6 g 組療效最好，6 g∶6 g 組次之，12 g∶6 g 組最差，且6 g∶6 g 組與12 g∶6 g 組效果與15 g∶6 g 組相差較大，最終確定15 g∶6 g 組為最佳配比。

2.2 半仿生提取工藝優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，利用Box-Behnken 中心組合實驗的設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平的29 個實驗點。各實驗點GABA 和5-HT 的含量測定結(jié)果見表6。

2.2.1 回歸模型的建立與擬合

采用Design-Expert 軟件對上面數(shù)據(jù)進行分析，以Y 對變量進行模型擬合，并通過系數(shù)（R2）等對擬合自模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，建立四元二次回歸方程Y=0.98+0.052A+0.0075B-0.0008C+0.025D+0.010AB+0.012AC+0.013AD+0.0075BC-0.060BD-0.022CD-0.042A2-0.059B2-0.051C2-0.068D2，運用Design-Expert 軟件對上述實驗點的響應(yīng)值進行方差分析。

由表7 可以看出，回歸模型P ＜0.01，F(xiàn)=11.41，提示模型具有高度差異性，同時該模型具有較高的相關(guān)系數(shù)（R2=0.9194），擬合度大于90%，且失擬值P >0.05，說明該模型能夠反映響應(yīng)值的變化，誤差小，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。

表6 四因素三水平中心組合實驗方案與結(jié)果

表7 方差分析

2.2.2 效應(yīng)面優(yōu)化分析

用Design-Expert 8.2.0 軟件對表6 實驗結(jié)果擬合分析，所得響應(yīng)面等高線曲面圖，見圖1。曲面陡表明該因素對綜合評分影響顯著，曲面平緩則表明該因素對綜合評分影響不顯著。

由圖1 可以看出，A、B、C、D 四個因素對綜合評分的影響均成拋物線關(guān)系。分析各圖，從圖①可以看出，A 曲面較陡，B 曲面較平緩，說明人工胃液的用量對綜合評分的影響顯著，而提取時間的影響不顯著。同理，從圖②可以看出，A 對綜合評分影響顯著，C 影響不顯著；從圖③可以看出，A 對綜合評分影響顯著，D 影響較顯著；從圖④可以看出，B 影響不顯著，D 影響較顯著；從圖⑤可以看出，B 和D 二者的提取時間交互作用顯著，說明BD 項對綜合評分影響顯著；從圖⑥可以看出C 不顯著，D 較顯著。

綜上可知，影響半仿生提取的主要因素為A，其次為D，其中以B、D 交互作用最為顯著。

圖1 A、B、C、D 四因素等高線圖和響應(yīng)面圖

2.2.3 提取工藝優(yōu)化結(jié)果及驗證試驗

根據(jù)回歸模型分析可知，半仿生提取的最佳條件為：第1 次提取人工胃液用量9.45 倍、時間2.43 h；第2 次提取人工腸液用量6.02 倍、時間3.65 h。按照優(yōu)化的處方劑量，結(jié)合實際操作情況，各因素值保留為整數(shù)，即第1 次提取人工胃液用量9.5 倍、時間2.5 h，第2 次提取人工腸液用量6.0 倍、時間3.6 h。在此條件下，按照中試規(guī)格要求，藥材用量采用處方量1000 倍進行3 次平行實驗，見表8。GABA 和5-HT 的含量的平均值分別為216.60 ng/g 和3508.11 pg/g，與理論值221.21 ng/g 和3533.38 pg/g 比較接近。說明該回歸方程與實際情況擬合較好，該最佳工藝切實可行，可操作性強。

表8 驗證試驗表

3 討論

中藥藥對配伍是基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論將兩味藥合用，通過藥物間的復(fù)雜配伍作用，有機地組合而成。酸棗仁與五味子藥對配伍以酸棗仁為主，但最佳配伍比例并不確定，本實驗基于鎮(zhèn)靜催眠作用篩選酸棗仁-五味子的最佳配比。結(jié)果顯示，酸棗仁與五味子不同配比均能對小鼠起到一定的鎮(zhèn)靜催眠作用，其中以酸棗仁：五味子（15 g∶6 g）療效最好，12 g∶6 g 組、6 g∶6 g 組療效雖然相差無異，但6 g∶6 g 組耗費藥材少。綜合分析可知：15 g∶6 g 組配比雖然用量大，但療效最佳，6 g∶6 g 組雖然給藥量小但效果等同于12 g∶6 g組，不及15 g∶6 g 組，又因五味子每天最大給藥量上限為6 g，故最終確定最佳配比為15 g∶6 g。

Glu 能夠在相應(yīng)合成酶谷氨酰胺的作用下轉(zhuǎn)變成Gln，屬于人體內(nèi)少有的興奮性氨基酸；而GABA屬于抑制性氨基酸，部分鎮(zhèn)靜催眠藥物的發(fā)揮作用主要與加強GABA 功能有關(guān)[15-17]。同時，神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA 兩者變化也可影響人體的睡眠[18-19]，所以本研究除上述3 種物質(zhì)外，也同時測定5-HT、5-HIAA 含量，以判斷酸棗仁-五味子不同配比的鎮(zhèn)靜催眠作用。

半仿生提取法是一種新的中藥提取技術(shù)，該法模擬胃腸道環(huán)境，采用接近于胃腸道PH 的酸性溶液和堿性溶液依次提取，提取簡便、不破壞有效成分、提取率高，能在一定程度上節(jié)約成本，較一般提取法的有效成分含量更高[20-22]；而且經(jīng)歷了模擬胃腸道環(huán)境的處理，生物活性有所增強，口服不存在胃腸道破壞情況。另外，酸棗仁五味子單獨提取時，采用半仿生提取法的鎮(zhèn)靜催眠效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)提取法[23-25]。