謝 珍 陳舒懷 劉 璐 何立成 朱社敏 匡榮

浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052

日常生活中，人們的眼睛偶爾會暴露于化妝品，如沐浴露及染發(fā)類產品等。因此，化妝品引起的潛在眼刺激性的評估對于確保產品安全是至關重要的[1-2]。近年來，許多發(fā)達國家已經立法，以禁止動物試驗并推廣替代技術。全球目前有近40 個國家/地區(qū)已經正式實施了化妝品動物試驗禁令，還有數(shù)十個國家正在立法的過程中，這些法規(guī)的變化對全球化妝品的產品研發(fā)、安全風險評估、立法監(jiān)督和國際貿易均產生深遠的影響[3-5]。而國內的化妝品安全性評價法規(guī)還是依據(jù)動物實驗為主，依據(jù)2015 版《化妝品安全技術規(guī)范》[6]中“急性眼刺激性/腐蝕性”項下規(guī)定，結合本實驗室多年的化妝品檢測經驗，沐浴露、染發(fā)類化妝品的眼刺激反應等級多為無刺激性、微刺激性至輕刺激性，加之傳統(tǒng)的Draize 試驗存在較多缺陷[7]，有必要尋找合適的體外測試方法。

牛角膜渾濁和滲透性（bovine corneal opacity and permeability，BCOP）試驗是經濟合作與發(fā)展組織（OECD）認可的眼刺激試驗的替代方法之一，可對無刺激性（不分類）和嚴重刺激性（1 類）的物質進行準確分類[8]，但對弱到中等刺激程度（2B 和2A 類）的樣品不能完全準確判斷[9]。到目前為止，沒有單一的體外替代方法能夠完全代替Draize 試驗[10]。角膜的組織病理學評估可作為BCOP 測試的附加參數(shù)，提供病變類型和損傷深度這些重要的補充信息[11]。盡管OECD TG 437[12]中尚未將角膜的組織病理學評估納入其中，但OECD 已發(fā)布了相關指導文件以促進這一評估的應用[13]。已有學者[14]將其與牛角膜的組織學觀察相結合建立預測模型，包括上皮、基質和內皮3 層結構，來對化學品的眼刺激性進行評估。本研究將BCOP 測得的結果與每種受試物對應的角膜上皮的相應組織病理學檢查結果進行比較，包括市售的沐浴露及染發(fā)劑，將角膜上皮的病變損傷分級與體外刺激評分值（IVIS）及Draize試驗的體內數(shù)據(jù)相結合，建立化妝品眼刺激性的預測模型，為化妝品的安全評估提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛眼球 牛眼球來源于浙江省富陽市九鮮肉牛定點屠宰場。試驗前日晚由屠宰場受訓人員于牛死亡后立即摘除眼球放入HBSS 溶液中，置運輸冷藏箱中運至實驗室。

1.1.2 實驗動物 普通級新西蘭家兔，購于浙江省桐鄉(xiāng)市銀海牧業(yè)專業(yè)合作社，生產許可證號：SCXK（浙）2018-0002，動物質量合格證號：No.1907170115，體重：1.9～2.6 kg，雌雄皆用。動物飼養(yǎng)于浙江省食品藥品檢驗研究院實驗動物中心，實驗動物房使用許可證號：SYXK（浙）2016-0009。動物飼料由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司提供，生產許可證號：蘇飼證（2019）01008。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。實驗動物試驗前在動物房適應環(huán)境至少3 d。動物實驗方法經浙江省食品藥品檢驗研究院動物福利和倫理委員會審核批準。

1.1.3 試劑與儀器 MEM 培養(yǎng)液（2053121）、MEM 培養(yǎng)液（含酚紅，2048092）、HBSS 緩沖液（1897082）購于美國gibco 公司；熒光素鈉（20170426）、無水乙醇（20190618）購于國藥集團化學試劑有限公司。

CTHI-150B 型恒溫恒濕箱[施都凱儀器設備（上海）有限公司]；OPACITOMETER 混濁度儀（德國DURATEC Analysentechnik GmbH）；MAX190 型紫外可見連續(xù)光譜酶標儀（美國Molecular Devices Corporation）。ST5010 自動載玻片染色機、EG1150 包埋機、HI1220 烘片機、RM2235 切片機、DM4000BLED 顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 Draize 試驗法 參照2015 版《化妝品安全技術規(guī)范》[6]“急性眼刺激性/腐蝕性”項下所示方法。每個樣品取沒有眼病的健康家兔3 只，染發(fā)劑類（#1、#2、#3、#4、#5）樣品按說明書進行配制，沐浴露類（#1、#2、#3、#4）樣品使用原液，將0.1 mL 的樣品加入一側結膜囊中，眼閉合1 s，至第4 秒（染發(fā)劑類）/第30 秒（沐浴露類）時用足量、流速較快但又不會引起動物眼損傷的水流沖洗30 s，另側眼睛不處理作自身對照，按要求對動物眼睛進行檢查并判定受試物對眼的刺激強度。

1.2.2 BCOP 試驗法 試驗方法按照OECD TG 437[12]，將分離的角膜安裝在角膜固定器中，平衡后測量初始濁度值，每個樣品平行3 個角膜，陰性對照為純化水，陽性對照為無水乙醇。分組后將角膜暴露于受試物中，染發(fā)類產品依據(jù)樣品說明書現(xiàn)配現(xiàn)用，其余受試物使用原液。孵育結束后讀取終末濁度值。加入熒光素鈉溶液孵育后在490 nm 波長處讀取后室液體的吸光度值并計算IVIS。IVIS≤3，無刺激性（GSH 不分類）；3＜IVIS≤55，輕微到中等刺激（GSH 為2A 或2B 類）；IVIS＞55，嚴重刺激（GSH 為1 類）。

1.2.3 組織制片及分析方法 測試結束后取下角膜，置于10%的中性福爾馬林溶液中固定，取材部位為角膜中間區(qū)域，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，角膜橫切面進行切片，厚度4 μm，使用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，用光學顯微鏡觀察角膜上皮細胞，基質和內皮細胞的組織病理學變化并拍照。角膜上皮的病變分級評分（H）標準如下：0 表示不值得注意；1 表示輕微；2 表示輕度；3 表示中度；4 表示嚴重。刺激分級根據(jù)角膜的病變部位：鱗狀細胞（輕微），鱗狀細胞至上翼狀細胞（輕度），鱗狀細胞至翼狀細胞下層（中度），基底細胞（嚴重）。

2 結果

2.1 受試物眼刺激性試驗結果

依據(jù)現(xiàn)標準，眼刺激性檢驗結果均合格，BCOP結合H 分類結果與Draize 試驗結果一致。見表1。

表1 受試物眼刺激性結果（n=3）

2.2 角膜組織病理學變化

暴露于不同受試物的角膜的具體組織學變化情況見圖1。（1）陰性對照：角膜3 層結構完整，最外層細胞由于生命周期的原因可見輕微脫落,H 值為0，見圖1A。（2）陽性對照：上皮表層鱗狀細胞凝固，翼狀細胞和基底細胞顯示出明顯的細胞質和細胞核空泡化，在基質的上半部分觀察到松散的膠原束和角膜細胞的腫脹，內皮完整，H 為4 分，見圖1B。（3）組織病理學評分較低（輕微），病變僅限于鱗狀細胞層，H 值為1：①沐浴露#1：最外層的鱗狀細胞可見輕微腫脹和脫落。其余未見明顯病理變化。內皮完整，見圖1C。②沐浴露#4：鱗狀細胞表現(xiàn)出連續(xù)的水腫及腫脹，可觀察到細胞核融合及腫脹。內部鱗狀細胞層未顯示出明顯的病理變化，維持了角膜上皮的分層結構。角膜基質無變化。內皮完整，見圖1D。③染發(fā)劑#1：最外層的鱗狀細胞可見輕微脫落。其余未見明顯病理變化。內皮完整，見圖1E。（4）組織病理學評分仍較低（輕度），且病變局限于鱗狀細胞和上翼狀細胞層，H值為2：①沐浴露#3：鱗狀細胞層部分缺失，細胞質的空泡化延伸至翼狀細胞層表層細胞。角膜基質無變化。內皮完整，見圖1F。②染發(fā)劑#4：鱗狀細胞呈圓形或橢圓形。在上翼狀細胞層中可觀察到細胞質的空泡化。與病變部位直接接觸的翼狀細胞表現(xiàn)出核凝結。其余未觀察到明顯變化。內皮完整，見圖1G。③染發(fā)劑#5：鱗狀細胞層完全缺失，在上翼狀細胞層中可觀察到細胞腫脹。其余未觀察到明顯變化。內皮完整，見圖1H。（5）組織病理學評分為中度，病變位于鱗狀細胞層至上、下翼狀細胞層，或嚴重至延伸到基底細胞，H 值為3 或4：①染發(fā)劑#2：整個鱗狀細胞層及表層翼狀細胞缺失，其余翼狀細胞可見顯著的細胞質空泡化?；准毎３滞暾?。角膜基質無變化。內皮完整，見圖1I。②沐浴露#2：鱗狀和上翼狀細胞層缺失，深層翼狀細胞層和基底細胞仍存在，在向基底細胞過渡區(qū)域的翼狀細胞周圍存在小空泡。角膜基質無變化。內皮完整，見圖1J。③染發(fā)劑#3：整個鱗狀細胞層缺失及剩余細胞之間的粘附喪失，連接斷裂。上翼狀細胞層腫脹明顯，呈圓形或橢圓形，深層翼狀細胞層和基底細胞仍存在，均顯示出更廣泛的細胞質空泡化和腫脹（細胞之間空隙清晰）。角膜基質無變化。內皮完整，見圖1K。

圖1 角膜組織病理學變化（HE 染色）

2.3 BCOP 結合角膜上皮組織學變化預測化妝品眼刺激性的分級標準

依據(jù)表1 和圖1，建立IVIS 結合角膜上皮病變評分的眼刺激性等級的預測模型，見表2。如果IVIS≤3，且H=0，則判定為無刺激性；如果IVIS≤6，且H≤1，則判定為微刺激性；如果6＜IVIS＜25，且角膜基質及內皮無異常，則判定為輕刺激性。

表2 BCOP 結合角膜上皮組織學變化預測化妝品眼刺激性的分級標準

3 討論

BCOP 測試由渾濁度和熒光素鈉通透性這兩個主要終點組成，來間接量化由測試物質引起的對角膜的損傷。渾濁度受角膜上皮蛋白質的沉淀或變性的影響。角膜上皮由從前到后由3 層組成：鱗狀細胞層、翼狀細胞層和基底細胞層，上皮細胞起源于基底細胞并分化成為翼細胞，然后分化成鱗狀細胞。角膜上皮在成人中大約每7 天會更新?lián)Q代1 次。眼部創(chuàng)傷后上皮細胞有絲分裂活躍[15-17]。此外，上皮細胞具有細胞間連接，例如緊密連接和黏附連接，其中緊密連接是角膜最頂端的結構，可消除細胞間隙以提供滲透性屏障。細胞間連接的破壞，如上皮層細胞變性、壞死或缺失，會增加上皮的通透性，進而顯著影響物質的眼刺激性潛力[18]。同時，物質對角膜上皮的細胞毒性是其作用的重要方式[19]，加之BCOP 方法對弱到中等刺激程度的樣品不能準確判斷。作為BCOP 測定的補充參數(shù)，病理組織學分析可確定角膜病變的深度及程度[20]。因此，角膜上皮的組織病理學評估可為眼刺激性分類提供更可靠的依據(jù)。

文中展示了9 種市售沐浴露和染發(fā)劑在BCOP測定中所觀察到的組織病理學特征，結果顯示組織，病理學結果與測試物質的IVIS 相當。IVIS 越大，物質損傷角膜的深度越深，組織學評分的分值越大[21]，提示角膜上皮的組織病理學特征為化妝品體外眼刺激性分類為無刺激性至輕刺激性提供更好的佐證。依據(jù)受試物的IVIS、角膜上皮組織學特征及Draize 試驗結果，本文建立了IVIS 結合角膜上皮組織學的預測模型來評估化妝品的眼刺激性，本研究將微刺激性和輕刺激性的IVIS 臨界值定為6，這與已有的文獻報道[22]一致，認為IVIS≤6 的物質引起的組織病理學變化僅限于鱗狀細胞層，且可迅速恢復。此外，即如果IVIS≤3，且H=0，則判定為無刺激性；如果IVIS≤6，且H=1，則判定為微刺激性；如果6＜IVIS＜25，且角膜基質及內皮無異常，則判定為輕刺激性。結合實驗室多年的化妝品檢測經驗，沐浴露、染發(fā)類化妝品的眼刺激反應等級多為無刺激性、微刺激性至輕刺激性，極少為中刺激性，未見腐蝕性[23]，依據(jù)文中9 種受試物的有限數(shù)據(jù)，該預測模型目前未把中刺激性和腐蝕性納入其中，雖尚未覆蓋全部刺激譜，但可將微刺激性和輕刺激性進行區(qū)分，滿足日?；瘖y品眼刺激性的評估工作?？傊?，結合角膜上皮組織病理學評分的BCOP 法可作為微刺激性或輕刺激性分類的依據(jù)，適用于化妝品眼刺激性的檢測。