葉文靜 林道斌 程亞偉 邱曉堂

廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬海南中醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南?？?570100

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）被廣泛認(rèn)為是繼“三高”之后的第4 個(gè)重要的疾病危險(xiǎn)因素[1]。據(jù)估計(jì)，我國(guó)沿海和經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)HUA 患病率在20%以上，已接近歐美發(fā)達(dá)國(guó)家水平。尿酸（UA）的升高，會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)腎病、心血管疾病的發(fā)生，并與肥胖、胰島素抵抗、高血壓發(fā)病等密切相關(guān)[2]。中藥具有作用多、靶點(diǎn)廣、副作用少的優(yōu)點(diǎn)，在HUA 的治療中具有很高的研究應(yīng)用價(jià)值。四妙散來(lái)源于清代張秉成的《成方便讀》，由黃柏、薏仁、蒼術(shù)、牛膝構(gòu)成。現(xiàn)代中藥藥理研究表明，四妙散能夠抑制UA 合成酶XOD、XDH 活性，下調(diào)大鼠UA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1、GLUT9 表達(dá)，上調(diào)OAT1 表達(dá)而降低UA[3-4]。臨床治療方面，加味四妙散不僅能顯著降低UA，還能緩解全身癥狀，減少心血管事件發(fā)生[5-6]。目前對(duì)四妙散治療HUA 的作用機(jī)制研究大多是從單一成分或單一靶點(diǎn)進(jìn)行的，這與多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)的中藥治療本質(zhì)背道而馳。因此本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)四妙散治療HUA 進(jìn)行系統(tǒng)性探討，為四妙散治療HUA 提供理論基礎(chǔ)及方法依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 四妙散有效成分收集與篩選

本研究以中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmspsearch.php）檢索關(guān)鍵詞“黃柏、蒼術(shù)、牛膝、薏苡仁”以獲得四妙散所有活性成分，并將篩選活性成分的條件設(shè)定為口服利用度（OB）≥30%和化合物類(lèi)藥性（DL）≥0.18[7]。

1.2 藥物靶點(diǎn)的篩選與獲取

將藥物成分分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為mol2 格式儲(chǔ)存，然后上傳至DRAR-CPI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cpi.bio-x.cn/drar/）[8]。篩選靶點(diǎn)蛋白PDB ID，依據(jù)（Z-score）＜-1，最后導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/uniprot/P0A0N5）得到靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)基因。

1.3 獲取疾病靶點(diǎn)與交集靶點(diǎn)

通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），獲取HUA 疾病靶點(diǎn)，并與“1.1”項(xiàng)下篩選出的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，得到交集靶點(diǎn)。

1.4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立

為進(jìn)一步分析藥物作用的機(jī)制，本研究將四妙散有效成分及其作用的HUA 靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件建立網(wǎng)絡(luò)模型，得到活性成分-靶點(diǎn)關(guān)系圖，并依據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)之間的連接數(shù)目進(jìn)行分析。

1.5 四妙散治療HUA 的富集分析

將“1.3”項(xiàng)下獲取的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 工具（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（GO）、京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）分析，并使用Rx64 3.6.2將GO 分析結(jié)果及KEGG 結(jié)果制成可視化圖和高級(jí)氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 四妙散有效成分及靶點(diǎn)信息的篩選結(jié)果

經(jīng)TCMSP 平臺(tái)檢索，共獲得四妙散活性成分50 種，其中黃柏24 種、蒼術(shù)4 種、牛膝16 種、薏苡仁6 種，藥物靶點(diǎn)經(jīng)DRAR-CPI 平臺(tái)共檢索到288 個(gè)，去重后有36 個(gè)。

2.2 疾病靶點(diǎn)及四妙散治療HUA 靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得471 個(gè)HUA 相關(guān)靶點(diǎn)，與TCMSP 平臺(tái)得到的藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，得到8 個(gè)治療HUA 的潛在靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.3 活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的構(gòu)建

圖1 HUA 疾病靶點(diǎn)與藥物作用靶點(diǎn)韋恩分析圖

活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中共有36 個(gè)節(jié)點(diǎn)，89 條邊。深色節(jié)點(diǎn)代表有效化合物，淺色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)。以度值（Degree）作為反映節(jié)點(diǎn)大小的依據(jù)，Degree 數(shù)值越大，節(jié)點(diǎn)越大。在活性成分方面，Degree 最高的活性成分分別為黃藤素（palmatine）10 個(gè)、豆甾醇（stigmasterol）9 個(gè)、小檗堿（berberine）8 個(gè)、黃連堿（coptisine）6 個(gè)、漢黃芩素（wogonin）6 個(gè)。在靶點(diǎn)方面，Degree 最高的靶點(diǎn)是前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、類(lèi)視黃醇X 受體（RXR）、α 雌激素受體（ESR1）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3），分別對(duì)應(yīng)35 種、17 種、15 種、11 種藥物活性成分。見(jiàn)圖2。

2.4 四妙散治療HUA 的富集分析結(jié)果

GO 分析根據(jù)閾值P ＜0.05，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01 確定了26 條GO 富集分析條目，其中生物過(guò)程有16 條，分子功能有7 條，細(xì)胞成分有3 條，見(jiàn)表1。同時(shí)根據(jù)FDR＜0.01 找到了11 條作用通路，見(jiàn)表2。表1、表2 分別列舉了FDR 最小的GO 和KEGG 通路分析結(jié)果。

為了使作用通路進(jìn)一步可視化，制作了GO 分析條形圖（圖3，封四）和KEGG 分析氣泡圖（圖4，封四）。如圖3 所示，四妙散在生物過(guò)程中對(duì)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)調(diào)控、雌二醇的反應(yīng)作用較大；在分子成分中，對(duì)細(xì)胞膜作用較大，在分子功能上，對(duì)酶結(jié)合的作用較大。如圖4 所示，cGMP-PKG 信號(hào)通路所在P 值最小，基因數(shù)最多，表明四妙散對(duì)此通路影響最大，而對(duì)脂肪細(xì)胞中脂解調(diào)節(jié)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌通路、雌激素信號(hào)通路的影響次之。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)了28 種四妙散治療HUA 的主要活性成分，Degree 最高的前兩種活性成分為黃藤素和豆甾醇。黃藤素主要成分為鹽酸巴馬汀，通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激、抑菌消炎等生理功效發(fā)揮作用[9-10]。豆甾醇主要通過(guò)抗氧化、消炎、降脂、調(diào)節(jié)胰島素抵抗等發(fā)揮作用[11-13]。本研究推測(cè)黃藤素和豆甾醇可能通過(guò)降低胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥、調(diào)節(jié)代謝紊亂等途徑對(duì)HUA 間接發(fā)揮效用。

圖2 活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖3 活性成分靶點(diǎn)的GO分析條形圖(FDR<0.01)

圖4 四妙散治療HUA的靶點(diǎn)KEGG分析氣泡圖(FDR<0.01)

表1 活性成分靶點(diǎn)的GO 分析結(jié)果（FDR＜0.01）

表2 活性成分靶點(diǎn)的KEGG 分析結(jié)果（FDR＜0.01）

靶點(diǎn)方面，本研究發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)治療HUA 的核心靶點(diǎn)，Degree 最高的靶點(diǎn)分別是PTGS2、RXRA、ESR1、NOS3。

前列腺素G/H 合酶1（PTGS1）與PTGS2 合稱為環(huán)氧合酶（COX-1/2）。由于COX-1 在HUA 發(fā)病過(guò)程中鮮有報(bào)道，故研究集中在COX-2。COX-2 可誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等產(chǎn)生，并由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞釋放合成前列腺素（PG），進(jìn)而產(chǎn)生發(fā)熱、疼痛和炎癥反應(yīng)[14]。有研究顯示，UA 可通過(guò)血栓烷A2 引起血管平滑肌細(xì)胞增殖并上調(diào)其COX-2 mRNA 的表達(dá)，而選擇性的COX-2 抑制劑及血栓烷A2 拮抗劑可顯著降低UA[15]。此外，隨著UA 濃度的升高及代謝時(shí)間的延長(zhǎng)，血管平滑肌細(xì)胞COX-2也隨之升高[16]。另有報(bào)道稱，沉積在關(guān)節(jié)中的尿酸鹽結(jié)晶能夠刺激COX-2 表達(dá)增加，尤其在痛風(fēng)急性期，血清中COX-2 水平較慢性期明顯增高[17]。因此，四妙散可能通過(guò)作用于COX 靶點(diǎn)抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而恢復(fù)UA 代謝平衡。

RXRA 與視黃酸受體（RAR）形成核受體家族[18]。RXR/RAR 的活化受視黃醇結(jié)合蛋白4 （RBP4） 的影響。由脂肪細(xì)胞分泌的RBP4 是一種小分子蛋白，主要在腎小管處重吸收[19]。高璐等[20]、Elizalde-Barrera 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HUA 患者血漿中RBP4 水平較不伴隨危險(xiǎn)因素的高尿酸血癥患者顯著升高，血漿RBP4 與HUA 的發(fā)生中心環(huán)節(jié)主要是胰島素抵抗，胰島素抵抗會(huì)增加腎小管對(duì)鈉和UA 的重吸收，減少尿液中UA 的排泄，從而形成HUA。因此，四妙散作用于RXRA 靶點(diǎn)對(duì)改善胰島素抵抗，減少UA 排泄有積極作用。

雌激素受體是一種由ESR1 和β 雌激素受體（ESR2）調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)分子。Zeng 等[22]發(fā)現(xiàn)雌二醇通過(guò)結(jié)合ESR2 在轉(zhuǎn)錄后期下調(diào)GLUT9 表達(dá)，減少UA的重吸收。相關(guān)研究顯示，絕經(jīng)期女性UA 水平高于非絕經(jīng)期婦女，而雌二醇較其長(zhǎng)期居于較低水平，二者間呈負(fù)相關(guān)[23]。據(jù)此，本研究推測(cè)四妙散可能通過(guò)補(bǔ)充體內(nèi)雌激素及作用于尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降低UA。

一氧化氮（NO）具有舒張血管、抑制白細(xì)胞黏附及血小板聚集等特性，在血管生成及神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用，而NOS3 是NO 合成途徑中的關(guān)鍵限速酶[24]。有研究發(fā)現(xiàn)在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，細(xì)胞內(nèi)活性氧大量增加，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致NO 失活，損害腎血管內(nèi)皮細(xì)胞，影響Na+運(yùn)動(dòng)，抑制UA 排泄[25]。Serizawa 等[26]發(fā)現(xiàn)抑制一氧化氮合酶活性及NOS3 氧化磷酸化的偶聯(lián)被破壞，可減輕胰島素抵抗引起的內(nèi)皮因子損傷。由此，說(shuō)明四妙散作用于NO 靶點(diǎn)，可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、降低胰島素抵抗發(fā)揮作用。

此外，本研究還確定了11 條相關(guān)通路，如通路VEGF 是一種血管再生物質(zhì)，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管再生，改善腎缺血組織的側(cè)支循環(huán)及灌注，增加腎小球?yàn)V過(guò)率及UA 排泄[27-28]。雌激素信號(hào)通路異常通常與代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[29]。據(jù)報(bào)道，雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或抑制XOD 系統(tǒng)，或通過(guò)減少肝臟脂肪堆積抑制戊糖磷酸途徑的活化，從而降低UA[30]。因此對(duì)相關(guān)通路的調(diào)控也是四妙散治療HUA 的關(guān)鍵步驟。