程 文 潘廣銳 曾安貴 王 毅 李 攀

1.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院 攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川攀枝花 617067；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康健城院區(qū)乳腺外科，四川瀘州 646000

2018 年全球乳腺癌發(fā)病率和死亡率分別排在第二位和第四位[1]，近年來乳腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增長，嚴(yán)重影響人們的生命健康[2]。乳腺癌早期癥狀不典型，僅有25%的患者處于Ⅰ期時被發(fā)現(xiàn)，而約70%的患者到晚期才被確診，因此提高早期乳腺癌的檢出率尤為重要[3]。糖類抗原153（CA153）是一種血型抗原，在卵巢癌和肝癌患者中CA153 高表達(dá)，且與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。微小RNA（miR）是一類短鏈RNA，其能夠調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖和化療藥物耐藥性等，在腫瘤診斷中的臨床價值逐漸得到重視[6-8]。其中微小RNA-10b（miR-10b）在正常組織中低表達(dá)，研究報道顯示，在肝癌和宮頸癌等腫瘤當(dāng)中miR-10b 表達(dá)量上調(diào)，并且與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖密切相關(guān)[9-10]。目前對于CA153、miR-10b 在早期乳腺癌中的作用仍然缺乏了解，本研究檢測血清CA153、miR-10b 水平，旨在探討其在早期乳腺癌患者中的水平及其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年2 月—2020 年2 月攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）診治的79 例早期乳腺癌患者作為研究對象，并將其納入乳腺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)診斷確診為乳腺癌[11]；②TNM 分期為0 期和Ⅰ期；③臨床資料完整；④行乳腺癌根治術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型腫瘤；②存在嚴(yán)重肝腎功能損傷；③入院前接受過放化療治療；④存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移者。乳腺癌組年齡35～65 歲，平均（53.71±18.26）歲；雌激素受體（ER）陽性59 例，ER 陰性20 例；孕激素受體（PR）陽性62 例，PR 陰性17 例；人表皮生長因子受體2（HER2）陽性57 例，HER2 陰性22 例；49 例絕經(jīng)，30 例未絕經(jīng)；40 例腫瘤直徑≤3 cm，39 例腫瘤直徑＞3 cm；低分化患者20 例，高中分化患者59 例；TNM 分期0 期患者44 例，TNM 分期Ⅰ期患者35 例。選擇同期于我院進(jìn)行健康體檢的42 名健康體檢者作為對照組，年齡37～66 歲，平均（54.02±17.89）歲；25 名絕經(jīng)，17 名未絕經(jīng)。兩組年齡和月經(jīng)狀態(tài)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。臨床研究開展均與患者和體檢人員簽署知情同意書，臨床研究開展經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 血清CA153 水平檢測 研究對象入院后抽取3 mL空腹靜脈血，室溫靜置1 h，5000 r/min 離心20 min，離心半徑12.5 cm。收集血清凍存于-80℃。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清CA153 水平，使用CA153 檢測試劑盒（美國Abcam 科技有限公司，貨號ab108633）檢測血清CA153 水平，實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 血清miR-10b 表達(dá)水平檢測 使用血清總RNA 提取試劑盒（miR-Neasy Serum/Plasma Kit）和RNA 轉(zhuǎn)錄試劑盒（miScript ⅡRT Kit）完成總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄（均購自于德國凱杰公司），具體流程：將血清樣本2 mL 與Trizol 溶液充分混勻后室溫下靜置5 min，加入氯仿0.2 mL 振蕩以提取總RNA。采用Agilents RNA LabChip Bioanalyzer 儀（ARLC&2100B，購自美國Agilent 公司）驗純后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：RNA 1 μg，2×RT mix 12 μL、Random hexamers 1 μL，最后加入RNase Free H2O 5 μL；反應(yīng)條件：25℃持續(xù)時間5 min，50℃持續(xù)時間15 min，85℃持續(xù)時間5 min。U6 為內(nèi)參基因，上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-10b 上游引物序列：5’-CGCACAAATTCGGATCTACA-3’，下游引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-10b、U6 引物序列均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。于7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：SYBR Taq Ⅱ10 μL，ROX Dye Ⅱ0.4 μL，U6 primer 1.6 μL，cDNA 2 μL，RNase Free H2O 6 μL；擴(kuò)增條件：95℃持續(xù)10 s 變性，然后95℃持續(xù)5 s，60℃持續(xù)20 s，95℃持續(xù)1 min，共40 個循環(huán)；每個樣本均設(shè)3 個復(fù)孔后取平均值。miR-10b 相對表達(dá)量采用2-△△Ct表示，△Ct（miR-10b）=Ct（miR-10b）-Ct（U6），△△Ct=△Ct（miR-10b）-△Ct（校準(zhǔn)標(biāo)本）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征曲線（ROC）分析血清CA153、miR-10b 水平對早期乳腺癌的診斷價值。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象血清CA153、miR-10b 水平比較

乳腺癌組血清CA153、miR-10b 水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組研究對象血清CA153、miR-10b 水平比較（）

表1 兩組研究對象血清CA153、miR-10b 水平比較（）

注：CA153：糖類抗原153；miR-10b：微小RNA-10b

2.2 乳腺癌組患者血清CA153、miR-10b 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同ER、組織學(xué)分化及TNM 分期乳腺癌患者血清CA153 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。不同HER2、TNM 分期乳腺癌患者血清miR-10b 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌組患者血清CA153、miR-10b 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（）

表2 乳腺癌組患者血清CA153、miR-10b 水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（）

注：ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；HER2：人表皮生長因子受體2；CA153：糖類抗原153；miR-10b：微小RNA-10b

2.3 血清CA153、miR-10b 對早期乳腺癌的診斷價值分析

CA153 聯(lián)合miR-10b 診斷早期乳腺癌的曲線下面積（AUC）、敏感度和特異度高于CA153、miR-10b單獨檢測，具體數(shù)據(jù)見表3，ROC 曲線見圖1。

表3 血清CA153、miR-10b 對早期乳腺癌的診斷價值分析

3 討論

圖1 血清CA153、miR-10b 對早期乳腺癌的診斷價值分析

乳腺癌是較為常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均排在婦科惡性腫瘤首位，對女性健康造成嚴(yán)重影響[12-15]。目前對乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍然缺乏了解，已有的研究報道顯示，腫瘤免疫逃逸、腸道微生物菌群失調(diào)、miR 調(diào)控機(jī)制以及促癌基因活化等因素均會造成乳腺癌的發(fā)生，其中miR 調(diào)控機(jī)制和促癌基因活化在乳腺癌診斷和治療中的臨床價值得到廣泛關(guān)注[16-17]。尋求與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的miR和促癌基因并將其應(yīng)用于乳腺癌的診斷和治療中是今后乳腺癌研究的重要方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌患者血清CA153 水平異常升高，且與ER 表達(dá)、分化程度和TNM 分期有關(guān)。分析其原因可能是由于CA153 能夠促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Liu 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，糖基化修飾的CA153能夠活化絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。由于絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤增殖、細(xì)胞周期和腫瘤干細(xì)胞維持等過程，因此早期乳腺癌患者在血清CA153 水平升高的同時其糖基化水平升高，糖基化CA153 與腫瘤細(xì)胞表面的酪氨酸受體結(jié)合，進(jìn)而活化絲氨酸-蘇氨酸激酶信號通路并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[19]。由于乳腺癌分化程度與乳腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)，因此CA153 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖會導(dǎo)致乳腺癌分化程度下降[20]。同時，黃增光等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，CA153 與ER 共定位于細(xì)胞膜上。CA153 屬于黏蛋白家族成員，是一種糖蛋白分子。ER與乳腺癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，ER 陰性的乳腺癌細(xì)胞增殖能力異常提高。早期乳腺癌患者中CA153 與ER 結(jié)合并抑制ER 活性，進(jìn)而解除ER 對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖能力異常提高[22]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，早期乳腺癌患者血清miR-10b表達(dá)水平異常升高，且在HER2 陰性和TNM 分期Ⅰ期患者中表達(dá)水平異常升高。分析其原因可能是由于miR-10b能夠作用于抑癌基因的信使RNA，唐靜等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中Kruppel 樣因子4（KLF4）抑癌基因是miR-10b 直接作用靶點，miR-10b 與KLF4 信使RNA 結(jié)合并誘導(dǎo)其降解，導(dǎo)致KLF4 基因表達(dá)下調(diào)，因此在乳腺癌中miR-10b 能夠抑制抑癌基因的表達(dá)，阻斷抑癌基因?qū)θ橄侔┌l(fā)生、發(fā)展的抑制作用，導(dǎo)致乳腺癌惡化[24]。HER2 陰性的乳腺癌細(xì)胞惡性程度較高，患者的預(yù)后較差。miR-10b 的作用機(jī)制主要包括兩個方面：一個方面，miR-10b 可以直接與信使RNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)；miR-10b抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[25-26]，因此在早期乳腺癌患者中miR-10b 可能與HER2 基因的信使RNA 結(jié)合而促進(jìn)其降解，使HER2 表達(dá)下調(diào)。另一個方面，miR-10b 可能會抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成，導(dǎo)致HER2 基因的轉(zhuǎn)錄無法完成，最終導(dǎo)致HER2 表達(dá)下調(diào)[27]。目前對miR-10b 調(diào)節(jié)HER2 表達(dá)的分子機(jī)制仍然缺乏了解，需要進(jìn)一步深入探究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CA153 聯(lián)合miR-10b 診斷早期乳腺癌的臨床價值高于CA153、miR-10b 單獨檢測，分析其原因可能是由于CA153 和miR-10b 并不是乳腺癌的特征性標(biāo)志物，在其他類型腫瘤中均能夠檢測到CA153 和miR-10b 異常表達(dá)，因此將CA153 和miR-10b 聯(lián)合診斷能夠有效提高其特異性，對早期乳腺癌的診斷價值也隨之提高。

綜上所述，早期乳腺癌患者血清CA153、miR-10b水平異常升高，血清CA153 與ER 表達(dá)、分化程度和TNM 分期有關(guān)，血清miR-10b 與HER2 表達(dá)和TNM分期有關(guān)，兩者聯(lián)合檢測在早期乳腺癌的診斷中具有一定臨床價值。