葉耀輝，馬亞男，喬欣

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004）

木香始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]，木香又名蜜香《名醫(yī)別錄》、青木香《木香經(jīng)集注》、南木象《世醫(yī)得效方》、廣木香《普濟(jì)方》[2]。木香為菊科植物木香（Aucklandia lappaDecne.）的干燥根，現(xiàn)代研究表明木香內(nèi)含揮發(fā)油、生物堿、樹(shù)脂、菊糖及甾醇等成分，其性溫，味辛、苦，歸脾、胃、大腸、膽、三焦經(jīng)，具有行氣止痛、健脾消食的功效[3]。中醫(yī)常常用其來(lái)治療消化不良、嘔吐、胃部脹滿、腹痛和腹瀉等癥，具有行氣止痛、芳香健胃的功效，是常用理氣藥。藥理研究表明，木香揮發(fā)油具有顯著的生理活性，木香揮發(fā)油具有抗炎、抗腫瘤、抗?jié)駸?、瀉痢解痙、降壓抗菌等作用[4]。目前木香揮發(fā)油提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、超臨界二氧化碳萃取法、微波萃取法等[5-8]。近年來(lái)除了上面所述的幾種揮發(fā)油提取方法，關(guān)于用超聲輔助法提取揮發(fā)油的研究也較多。楊麗霞等[9]采用超聲提取法提取石菖蒲揮發(fā)油，以揮發(fā)油得率(%)及β-細(xì)辛醚含量(mg/g)為指標(biāo)，以3 因素5 水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)考察料液比、超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)提取工藝的影響,運(yùn)用效應(yīng)面法優(yōu)選石菖蒲中揮發(fā)油的超聲提取工藝，最終優(yōu)選的提取工藝為料液比0.08 g/mL、超聲時(shí)間36.56 min、超聲功率181.64 W，并驗(yàn)證此工藝穩(wěn)定可行。謝志新等[10]以料液比、粉碎粒徑、超聲時(shí)間作為考察因素，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助提取八角茴香油的工藝參數(shù)進(jìn)行了研究，同時(shí)以維生素C 標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，通過(guò)測(cè)定其對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基及DPPH 自由基的清除能力考察其體外抗氧化活性。結(jié)果最佳提取工藝的最佳條件是料液比1:15、粉碎粒徑60 目、超聲時(shí)間30 min。目前關(guān)于采用超聲輔助法提取木香揮發(fā)油的研究報(bào)道較少，基于此，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)選超聲提取木香揮發(fā)油的工藝，同時(shí)采用GC-MS 法對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，對(duì)木香揮發(fā)油的研究具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 7890A-5975C 型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；SQP 型萬(wàn)分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；KQ200DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料

木香藥材購(gòu)于安徽亳州中藥材大市場(chǎng)，經(jīng)龔千鋒教授鑒定為菊科植物木香（Aucklandia lappaDecne.）干燥的根；石油醚（60～90 ℃，分析純），西隴科學(xué)股份有限公司；無(wú)水Na2SO4（分析純），西隴科學(xué)股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 木香揮發(fā)油的提取

精密稱取3 g 柴胡藥材，置于合適錐形瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案加入一定體積的石油醚和一定的提取溫度，超聲輔助提取一定時(shí)間后，加入約3 g 的無(wú)水Na2SO4過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮后稱重。

1.3.2 得油率的計(jì)算

式中：M1 為木香揮發(fā)油質(zhì)量（g），M2 為木香藥材粉末質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素分析

1.3.3.1 料液比對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響

在時(shí)間和溫度一定條件下，考察料液比（g/mL）（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響。

1.3.3.2 提取溫度對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響

在料液比和時(shí)間一定條件下，考察提取溫度（25、30、40、50、60、70 ℃）對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響。

1.3.3.3 提取時(shí)間對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響

在料液比和溫度一定條件下，考察提取時(shí)間（20、25、30、35、40、45 min）對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲輔助提取工藝

按照Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)基本原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，優(yōu)化選取料液比、提取溫度及超聲時(shí)間3 個(gè)影響因素，以木香揮發(fā)油得率為指標(biāo)，采用3 因素3 水平的響應(yīng)曲面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)分析因點(diǎn)，5 個(gè)中心點(diǎn)。

表1 因素水平Table 1 Factor levels

1.3.5 木香揮發(fā)油GC-MS 分析

1.3.5.1 GC 條件

進(jìn)樣量：1.0 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣口分流比：50:1；載氣：He 氣。色譜柱：毛細(xì)石英管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；柱流速：1.0 mL/min，平均線37 cm/sec；升溫程序：初始溫度75 ℃，以5 ℃/min升至120 ℃，保持10 min，再以3 ℃/min升至150 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持1 min。

1.3.5.2 MS 條件

MS 電離能量：70 eV；電子倍增管電壓：1847 V；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：30～550 u。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素分析

2.1.1 料液比對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響

圖1 料液比對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of volatile oil from Aucklandia odora

由圖1 可知，料液比大于1 g:20 mL 時(shí)，木香揮發(fā)油的得率隨著提取溶劑的增加而顯著增大。當(dāng)料液比小于1 g:20 mL 時(shí)，木香揮發(fā)油的得率并沒(méi)有隨著提取溶劑比例的增加而增加，而是總保持在一定水平。這是由于在設(shè)定的條件下當(dāng)料液為1 g:20 mL 時(shí)揮發(fā)油已經(jīng)基本溶于溶劑中。故從多方面考慮，選擇最佳料液比為1 g:20 mL。

2.1.2 提取溫度對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響

由圖2 可以看出，當(dāng)提取溫度從室溫（25 ℃）到50 ℃時(shí)，木香揮發(fā)油得率隨著提取溫度增加而不斷不增大。提取溫度不斷地增加，分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，加快木香揮發(fā)油成分向外擴(kuò)散，得油率增大。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，木香揮發(fā)油得率達(dá)到最大。但隨著溫度不斷擴(kuò)大，木香揮發(fā)油得率逐漸下降，這可能是溫度過(guò)高會(huì)破壞木香揮發(fā)油中化學(xué)成分，或者是使其中的成分揮發(fā)。故最佳提取溫度為50 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of volatile oil from Aucklandia odora

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of volatile oil from Aucklandia odora

如圖3 顯示，隨著超聲提取時(shí)間的逐漸增加，木香揮發(fā)油得率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。在35 min時(shí)，木香揮發(fā)油得率達(dá)到最高。超聲提取時(shí)間短時(shí)，木香揮發(fā)油提取不充分，提取率低；超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，木香揮發(fā)油中有效成分揮發(fā)或分解或破壞，提取率下降。故選擇超聲時(shí)間30 min 為最佳超聲時(shí)間。

2.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示。采用響應(yīng)面軟件Design-Expert.V8.0.6 軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。同時(shí)，以木香揮發(fā)油得率Y 為響應(yīng)值，料液比(A)、提取溫度(B)、超聲時(shí)間(C)為自變量，得到擬合方程：

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of regression model

通常使用數(shù)學(xué)模型來(lái)描述重要的自變量與R響應(yīng)之間的關(guān)系，其中二階多項(xiàng)式模型是優(yōu)化研究中廣泛應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚11,12]。在模型中，F(xiàn) 值越大，p值越小，越表示對(duì)各自響應(yīng)變異性更顯著影響[13]。回歸模型p＜0.0001，表明回歸模型達(dá)極顯著水平；因素A、C、AC、BC、A2、B2、C2的p＜0.05 或p＜0.001，表明其對(duì)揮發(fā)油得率的差異影響較顯著或極顯著，而因素B、AB 的p＞0.05，均表現(xiàn)其對(duì)揮發(fā)油得率的差異影響不顯著。失擬項(xiàng)p=0.4486＞0.05，不顯著，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9953，調(diào)整決定系數(shù) R2adj=0.9892，信噪比S/N=31.224＞＞4，表明模型可靠，說(shuō)明該模型成立。以上數(shù)據(jù)均表明該回歸方程的擬合度與可信度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，該模型可用于超聲輔助提取木香揮發(fā)油工藝結(jié)果的分析與預(yù)測(cè)。

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖4 料液比、溫度交互作用對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of the effect of solid-liquid ratio and temperature interaction on the yield of Aucklandia volatile oil

圖5 料液比、時(shí)間交互作用對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the effect of solid-liquid ratio and time interaction on the yield of volatile oil of Aucklandia odorifera

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖，分析料液比、提取溫度、超聲時(shí)間三個(gè)因素兩兩之間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。判斷3D 圖根據(jù)形成的平面坡面陡峭度來(lái)判斷顯著性，坡面越陡峭，因素的交互作用顯著；坡面平緩，則交互作用不顯著[14]。各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)木香揮發(fā)油的提取率的影響見(jiàn)下圖。圖4 至圖6 為各因素之間的交互作用的響應(yīng)圖，由圖知料液比和時(shí)間交互作用，溫度和時(shí)間交互作用顯著，與表3中顯著性分析結(jié)果一致。

圖6 時(shí)間、溫度交互作用對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the effect of time and temperature interaction on the yield of Aucklandia volatile oil

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert.V 8.0.6 軟件求解回歸方程，以揮發(fā)油得率為響應(yīng)指標(biāo)，得到的最佳工藝參數(shù)為料液比為1:20.55，提取溫度為49.64 ℃，超聲提取時(shí)間為35.58 min，得油率為5.70%。為利于具體實(shí)驗(yàn)操作，調(diào)整最佳工藝參數(shù)為料液比為1:21，提取溫度為50 ℃，超聲提取時(shí)間為36 min。采用調(diào)整后的最佳工藝進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到揮發(fā)油平均得油率為5.60%（RSD 為1.17%），與理論預(yù)測(cè)值5.70%無(wú)顯著差異，表明了模型預(yù)測(cè)性良好。

2.3 木香揮發(fā)油GC-MS 分析

采用調(diào)整后的最佳超聲提取工藝提取木香揮發(fā)油適量，按“2.4”項(xiàng)下GC-MS 條件進(jìn)行氣質(zhì)分析，得其總離子流色譜圖（圖7），所得分離組分與NIST11.L質(zhì)譜庫(kù)中數(shù)據(jù)匹配及人工譜圖解析和參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，確定化合物名稱，并應(yīng)用色譜峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)油成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明共分離出56 個(gè)峰，鑒定了其中的35 個(gè)化合物，占木香揮發(fā)油的92.03%，所得的化合物大多為烯烴類化合物。其中含量較高（≥1.00%）的成分有：石竹素（1.50%）、(-)-異芳香烴-(V)（1.06%）、1-甲基環(huán)庚烯（1.96%）、1,4-環(huán)丁二烯（27.12%）、4-(1-甲基戊基)-1-環(huán)己烯-1-羧醛（4.78%）、11,11-二甲基螺環(huán)[2,9]十二烷-3,7-二烯（8.34%）、2-(3,8-二甲基-1,2,3,5,6,7,8,8a-八溴二苯醚-5-偶氮烯基)-2-甲基氧氟烷（3.80%）、3-苯基-1-環(huán)己烯（9.23%）、2-(2-甲基-2-丙烯基)-2-環(huán)己烯-1-酮（27.70%）等。楊琴芳等[16]采用有機(jī)溶劑法提取木香的揮發(fā)油，并用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分的分析鑒定，從揮發(fā)油中共鑒定了54 種化學(xué)成分，其中含量較高的成分包括去氫木香內(nèi)酯（39.13%）、二氫去氫木香內(nèi)酯（14.36%）、木香烴內(nèi)酯（2.75%）、單紫杉烯（6.18%）、愈創(chuàng)木烯（2.09%）、β-欖香烯（1.57%）、α-木香醇（1.53%）。陳飛龍等[18]采用水蒸氣蒸餾法提取木香的揮發(fā)油，用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分的分析鑒定，從揮發(fā)油中共鑒定了46 種化學(xué)成分，不同產(chǎn)地木香揮發(fā)油的主要成分組成均為內(nèi)酯類、萜類化合物，其主要成分分別為去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、二氫廣木香內(nèi)脂、三環(huán)[8.6.0.0(2,9)]十六-3,15-二烯、α-廣木香醇、β-廣木香醇、順式法呢醇、α-姜烯等成分。與楊琴芳、陳飛龍等研究的木香揮發(fā)油差異較大。木香主要活性成分去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯含量較少，可能與超聲處理并未完全破壞木香細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使藥效成分未完全溶出有關(guān)，但超聲輔助法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，超聲提取木香揮發(fā)油仍具有一定價(jià)值。

表4 木香揮發(fā)油GC-MS 分析Table 4 Analysis of volatile oil from Aucklandia odora by GC-MS

8 23.547 3-Buten-2-one,4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl) β-紫羅蘭香酮 C13H20O 192 0.99 9 24.078 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahy-dro-4a,8-dimethyl-2-(1-methyle-thenyl)-,[2R-(2α,4aα,8aβ)]-Naphthalene 1,2,3,4,4a,5,6,8a-辛氫化-4a,8-二甲基-2-(1-甲基乙烯基)-,[2R-(2α,4aα,8aβ)]-萘C15H22 202 0.34 10 25.291 (R)-2,4a,5,6,7,8-Hexahydro-3,5,5,9-tetramethyl-1H-benzocycloheptene R-2,4A,5,6,7,8-六氫-3,5,5,9-四甲基-1H-苯并環(huán)庚三烯 C15H24 204 0.22 11 26.811 Humulene Α-葎草烯 C15H24 204 0.11 12 27.083 Cyclohexanemethanol,4-ethenyl-.alpha.,alpha.,4-trimethyl-3-(1-methylethenyl)-, (1R,3S,4S)-欖香醇C15H26O 222 0.35 13 27.914 3,7,11-Trimethyl-3-hydroxy-6,10-dodecadien-1-yl acetate 3,7,11-Trimethyl-3-hydroxy-6,10-dodecadien-1-yl acetate C17H30O3 282 0.13 14 28.790 Caryophyllene oxyde 石竹素 C15H24O 220 1.50 15 31.393 eudesm-4-en-11-ol 桉葉-4,11-二烯 C15H26O 222 0.25 16 32.460 beta-Eudesmol β-桉葉醇 C15H26O 222 0.68 17 32.741 (-)-Isoaromadendrene-(V) (-)-異芳香烴-(V) C15H24 204 1.02 18 33.273 1-Cyclohexene-1-carboxaldehyde,4-(1-methylethenyl)-4-(1-甲基戊基)-1-環(huán)己烯-1-羧醛 C10H14O 150 4.78 19 33.452 1-Methylcycloheptene 1-甲基環(huán)庚烯 C8H14 110 1.20 20 33.819 1,4-Cyclooctadiene 1,4-環(huán)丁二烯 C8H12 108 27.12 21 34.620 3,4,4a,5,8,8a-hexahydro-8a-methyl-,trans-1(2H)-Naphthalenone 3,4,4a,5,8,8a-六羥基化-8a-甲基-反式-1(2H)-萘酮 C11 H16O 164 0.88 22 34.892 Guaia-9,11-diene Guaia-9,11-diene C15H24 204 0.49 23 35.421 trans-alpha-Bergamotene 反式α-佛手甘氨酸 C15H24 204 0.48 24 36.503 3-(2-Isopropyl-5-methylphenyl)-2-methylpropionic acid 3-(2-異丙基-5-甲基苯-2-甲基丙酸 C14H20O2 220 0.37 25 36.839 alpha-Bergamotenol α-佛手蘿卜素 C15H24O 220 0.28 26 40.674 11,11-Dimethyl-spiro[2,9]dodeca-3,7-dien 11,11-二甲基螺環(huán)[2,9]十二烷-3,7-二烯 C14H22 190 8.34 27 40.983 2-(3,8-Dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8aoctahydro-5-azulenyl)-2-methyloxirane 2-(3,8-二甲基-1,2,3,5,6,7,8,8a-八溴二苯醚-5-偶氮)-2-甲基氧氟烷 C15H24O 220 3.08 28 42.233 1-Oxaspiro[2.5]octane,5,5-dimethyl-4-(3-methyl-1,3-butadienyl)-5,5-二甲基-4-(3-甲基-1,3-丁二烯基)-1-氧雜環(huán)[2.5]辛烷 C14H22O 206 0.54 29 43.175 Dehydrocostuslactone 去氫木香內(nèi)酯 C15H20O2 232 0.32 30 44.333 5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid,methyl ester, (all-Z)- 5,8,11,14,17-二十碳五烯酸甲酯 C21H32O2 316 0.22 31 44.907 7,10,13,16-Docosatetraenoic acid,methyl ester 7,10,13,16-二十二碳四烯酸甲酯 C23H38O2 347 0.44 32 45.168 Methylicosa-5,8,11,14,17-pentaenoate 5,8,11,14,17-戊烯酸甲酯 C21H32O2 317 0.20 33 45.711 Benzene, 2-cyclohexen-1-yl- 3-苯基-1-環(huán)己烯 9.23 34 46.148 Costunolide 木香烴內(nèi)酯 C15H20O2 232 0.67 35 46.665 2-(2-Methyl-2-propenyl)-2-cyclohexen-1-one 2-(2-甲基-2-丙烯基)-2-環(huán)己烯-1-酮 C10H14O 150 22.70

圖7 木香揮發(fā)油GC 總離子色譜圖Fig.7 GC total ion chromatogram of volatile oil from Aucklandia odorifera

3 結(jié)論

3.1 Box-Behnken 響應(yīng)面法與均勻設(shè)計(jì)和傳統(tǒng)正交設(shè)計(jì)相比較，具有高精密度、較少的試驗(yàn)周期和次數(shù)的優(yōu)勢(shì)，模型預(yù)測(cè)性較好，其分析方法相對(duì)更加恰當(dāng)，更加接近實(shí)際情況。本研究運(yùn)用響應(yīng)面法考察料液比、提取溫度、超聲時(shí)間對(duì)木香揮發(fā)油得率的影響，以木香揮發(fā)油得油率為響應(yīng)值，得各因素與響應(yīng)值的回歸方程，求解方程，得最佳超聲提取工藝為：料液比為1:21，溫度50 ℃，時(shí)間36 min。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值具有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝可以準(zhǔn)確篩選出最佳提取工藝參數(shù)。

3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）方法是一種對(duì)被測(cè)樣品的組分實(shí)現(xiàn)定性定量分析的方法，近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用到中藥材成分分析方面[19,20]。本研究采用GC-MS 法分析木香揮發(fā)油組成成分，共分離出56 個(gè)峰，鑒定了其中的35 個(gè)化合物，占木香揮發(fā)油的92.03%，檢測(cè)出石竹素、(-)-異芳香烴-(V)、1,4-環(huán)丁二烯（27.12%）、2-(2-甲基-2-丙烯基)-2-環(huán)己烯-1-酮等成分。這表明使用GC-MS 法檢測(cè)木香揮發(fā)油組分是可行的、可靠的。