加列西·馬那甫，王建華，阿依孜克熱·依斯馬衣，阿布力克木·吾布力達(dá)

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

沙棘果可以作食物和藥物又名醋柳、酸刺等，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)植物。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)沙棘含有百種以上的化合物，有“維生素寶庫(kù)”、“神奇果樹(shù)”等美稱(chēng)。部分活性物質(zhì)在醫(yī)藥、保健、食品等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景[1-5]。黃酮和多糖是沙棘果中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的主要活性成分，作為水果或保健品，符合和滿足人們?nèi)粘Ｉ畹男枨蟆Ｉ臣悬S酮和多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗衰老、抗病毒、降血糖、抗心肌缺血、降血脂等作用；對(duì)病毒性心肌炎、大腸桿菌、枯草桿菌等具有抑制作用。同時(shí)改善免疫系統(tǒng)、抗氧化方面發(fā)揮重要作用[6-12]。

沙棘果在貯藏、運(yùn)銷(xiāo)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生一系列變化、從而導(dǎo)致商品價(jià)值的降低、尤其是在貯藏期間黃酮和多糖的損失比較嚴(yán)重、這主要與溫度、時(shí)間、氧氣等因素有關(guān)。我國(guó)的沙棘果活性成分的降解研究目前仍然處于初級(jí)階段。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上、采用響應(yīng)面法研究?jī)?chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度三因素對(duì)沙棘果中黃酮和多糖降解率的影響、優(yōu)化降解條件建立降解工藝參數(shù)與降解率之間的數(shù)學(xué)模型、確定最優(yōu)降解條件、取得沙棘果黃酮和多糖的最佳降解率，為研究沙棘果儲(chǔ)存期的選擇提供理論依據(jù)[13-22]。由于沙棘果中黃酮和多糖在儲(chǔ)存過(guò)程中易降解、因此深入研究沙棘果黃酮和多糖的降解規(guī)律及相關(guān)動(dòng)力的變化機(jī)制對(duì)控制有效成分的損失具有重要意義。目前，中草藥、水果等的降解動(dòng)力學(xué)研究主要集中在對(duì)有效成分含量變化的分析上、對(duì)沙棘果黃酮和多糖的降解規(guī)律的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文研究不同儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)沙棘果黃酮和多糖含量變化的影響，建立黃酮和多糖降解動(dòng)力學(xué)模型、效控制黃酮和多糖的降解過(guò)程、為延長(zhǎng)其貯藏期提供理論依據(jù)[23-25]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

TU-1810 型 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；恒溫水浴槽，上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

草酸、抗壞血酸、鹽酸、乙酸鈉、濃硫酸、乙醇、亞硝酸鈉、蘆丁、硝酸鋁、氫氧化鈉、苯酚均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘果中黃酮的測(cè)定

精稱(chēng)蘆丁對(duì)照品20 mg，置100.0 mL 量瓶中，加85%乙醇溶解，定容，搖勻。精取0、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 于25.00 mL 量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.40 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.40 mL，放置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液4 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算得回歸方程：

稱(chēng)取沙棘果粉末2 g，置于100.0 mL 的容量瓶中，加入50%乙醇80 mL，80 ℃水浴回流提取一定時(shí)間。抽濾，離心后合并清液，濃縮。精取適量提取液，按以上方法在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算降解率。

1.2.2 沙棘果中多糖的測(cè)定

精稱(chēng)葡萄糖對(duì)照品25 mg，置100.0 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精取0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL 于10.00 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，分別取1.0 mL 于10 mL 量瓶中，加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，加硫酸5 mL，立即搖勻，沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，以水同法作空白參比，在485 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算得回歸方程：y=0.11744x +0.052，r=0.9965。

將提盡黃酮后的殘?jiān)糜?00 mL 錐形瓶中，加入3 倍體積的95%乙醇沉淀，4 ℃冷藏過(guò)夜，高速冷凍離心，沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次后，真空干燥得粗多糖。精稱(chēng)粗多糖適量，置于50.00 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。精取多糖溶液1.0 mL，按以上方法在485 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算降解率。

式中：y：降解率；A1：待測(cè)液降解后的黃酮或多糖含量；A0：待測(cè)液初始黃酮或多糖的含量；A：總的黃酮或多糖含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以沙棘果為原料、研究?jī)?chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度對(duì)沙棘果黃酮和多糖降解率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘果黃酮和多糖降解工藝

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果、根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理、采用響應(yīng)面法、在三因素三水平上對(duì)沙棘果中黃酮和多糖的降解率進(jìn)行優(yōu)化研究。

1.2.5 沙棘果黃酮和多糖降解動(dòng)力學(xué)研究

取不同儲(chǔ)存時(shí)間的沙棘果樣品適量，配成溶液，取10 mL、按“1.2.1”和“1.2.2”項(xiàng)進(jìn)行黃酮和多糖含量的測(cè)定。

1.2.6 降解動(dòng)力學(xué)方程

食品的營(yíng)養(yǎng)成分在儲(chǔ)存加工過(guò)程中都會(huì)受到各種因素的影響而降解、降解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型基本上符合零級(jí)或一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型、可用以下模型描述。式（1）為零級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型、式（2）為一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分別考察了儲(chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度等因素對(duì)沙棘果黃酮、多糖降解率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儲(chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度對(duì)沙棘果黃酮、多糖的降解率有較大的影響。初步選定沙棘果黃酮、多糖的降解條件為儲(chǔ)存時(shí)間10 d、超聲時(shí)間110 min、提取溫度80 ℃。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘果黃酮、多糖降解工藝

2.2.1 試驗(yàn)安排與結(jié)果

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平的編碼Table 1 Box-behnken experimental design factors and horizontal coding

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果、以?xún)?chǔ)存時(shí)間（A）、超聲時(shí)間（B）、提取溫度（C）為自變量、黃酮、多糖降解率為響應(yīng)值、設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。因素水平編碼見(jiàn)表1；分析試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理Table 2 Experimental design and data processing of response surface

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of regression model variance

2.2.2 模型方程的建立與方差分析

應(yīng)用SAS 軟件對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到儲(chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度與沙棘果黃酮、多糖降解率之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y（黃酮）=71.54+0.4625A+0.05B-1.1625C+3.175AB+6.9AC+2.225BC-3.77A2-7.195B2-12.07C2

Y（多糖）=68.76+1.4625A-0.825B-1.0375C-4.325AB-0.6AC-4.475BC-11.255A2-9.43B2+9.305C2

由表3 分析結(jié)果可看出，黃酮模型p 為0.001（p＜0.01），極顯著。失擬差p 為0.2385（p<0.05）不顯著，說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)。由黃酮模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)對(duì)降解率不顯著；二次項(xiàng)對(duì)降解率極顯著；交互項(xiàng)AB 對(duì)降解率顯著、AC對(duì)降解率極顯著、BC 對(duì)降解率不顯著。由此可知，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，儲(chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度對(duì)沙棘果黃酮降解率的線性效應(yīng)和曲面效應(yīng)都顯著。多糖模型p 為0.007（p＜0.01），模型極顯著；失擬差p 為0.4（p＞0.05）不顯著,說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)。由多糖模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)對(duì)降解率不顯著；二次項(xiàng)對(duì)降解率極顯著；交互項(xiàng)AB、BC 對(duì)降解率顯著、AC 對(duì)降解率不顯著。由此可知、在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)、儲(chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度對(duì)沙棘果多糖降解率的線性效應(yīng)和曲面效應(yīng)都顯著。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化；根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖、考察擬合響應(yīng)曲面的形狀、分析各因素對(duì)沙棘果黃酮、多糖降解率的影響、結(jié)果見(jiàn)圖1黃酮曲線圖、圖2多糖的曲線圖。

等高線的形狀反映了交互效應(yīng)的強(qiáng)弱、橢圓形表示兩因素交互影響顯著、圓形則與之相反。由圖1~2可知、黃酮的降解中儲(chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度之間的交互作用較小。在多糖的降解中儲(chǔ)存時(shí)間、超聲時(shí)間、提取溫度與儲(chǔ)存時(shí)間之間有一定的交互作用、超聲時(shí)間與提取溫度之間的交互作用較小。

圖1 各因素交互作用對(duì)沙棘果黃酮降解率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the degradation rate of seabuckthorn fruit flavonoids

圖2 各因素交互作用對(duì)沙棘果多糖降解率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the degradation rate of seabuckthorn fructose

2.3 最佳降解條件的確定

通過(guò)響應(yīng)面法得到的最佳降解條件為黃酮：儲(chǔ)存時(shí)間為10 d，超聲時(shí)間為114 min，提取溫度為73.60 ℃、此時(shí)沙棘果黃酮的降解率為70.11%；多糖：儲(chǔ)存時(shí)間為10 h，超聲時(shí)間為115.50 min，提取溫度為 74.51 ℃，此時(shí)沙棘果多糖的降解率為68.20%。該回歸方程與實(shí)際情況很符合，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘果黃酮和多糖的降解條件是可行的。

2.4 沙棘果黃酮、多糖降解動(dòng)力學(xué)解析

2.4.1 反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定

黃酮、多糖的降解符合零級(jí)或一級(jí)反應(yīng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由式（1）和式（2）計(jì)算沙棘果熱處理過(guò)程中黃酮、多糖在相應(yīng)反應(yīng)級(jí)數(shù)下的降解速率常數(shù)k，并進(jìn)行線性回歸分析，得相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表4所示。

在一定儲(chǔ)存時(shí)間，通過(guò)比較反應(yīng)級(jí)數(shù)的反應(yīng)速率常數(shù)k 來(lái)推斷降解反應(yīng)的快慢，比較零級(jí)和一級(jí)反應(yīng)的線性回歸系數(shù)R2來(lái)推斷反應(yīng)級(jí)數(shù)，線性回歸系數(shù)R2較高說(shuō)明反應(yīng)符合此級(jí)數(shù)。由表4 可知，不論是零級(jí)還是一級(jí)反應(yīng)，沙棘果在不同儲(chǔ)存時(shí)間下黃酮、多糖的降解速率常數(shù)k 隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)應(yīng)的降解速率常數(shù)k 隨之增大，說(shuō)明沙棘果黃酮、多糖的降解是一級(jí)反應(yīng)；儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)將促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間達(dá)到5 d 時(shí)，黃酮、多糖的降解速率常數(shù)k 明顯增加，大小為多糖>黃酮，說(shuō)明儲(chǔ)存時(shí)間短可以抑制沙棘果黃酮、多糖的破壞，但儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)黃酮、多糖的降解影響比短儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)沙棘果黃酮、多糖的降解影響大。由表4 可知，在儲(chǔ)存時(shí)間0 d時(shí)，零級(jí)反應(yīng)和一級(jí)反應(yīng)的線性回歸系數(shù)R2差別不顯著，隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，一級(jí)反應(yīng)的回歸系數(shù)R2要高于零級(jí)反應(yīng)，說(shuō)明不論在何種條件，沙棘果黃酮、多糖在儲(chǔ)存過(guò)程中的降解過(guò)程均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。

表4 零級(jí)反應(yīng)和一級(jí)反應(yīng)的線性回歸系數(shù)R2Table 4 The linear regression coefficient R2 for the zero order reaction and the first order reaction

表5 不同儲(chǔ)存時(shí)間下黃酮、多糖降解半衰期、活化能和指前因子Table 5 Flavonoid, polysaccharide degradation half-time, activation energy and predactyl factor with different storage time

2.4.2 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定

將Arrhenius經(jīng)驗(yàn)公式左右兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)可得

對(duì)黃酮、多糖一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)的對(duì)數(shù)lnk與儲(chǔ)存時(shí)間的倒數(shù)1/T作線性回歸，由式（4）可知，由直線的斜率和截距分別求得反應(yīng)的活化能Ea和指前因子A，具體參數(shù)數(shù)值如表5所示。

由Arrhenius方程得到的降解活化能Ea可以認(rèn)為是黃酮、多糖降解時(shí)到達(dá)降解能峰所需要吸收的熱量，通常認(rèn)為化學(xué)反應(yīng)的活化能E0為40~400 kJ/mol，活化能E0越小，反應(yīng)越易進(jìn)行。當(dāng)E0<42 kJ/mol，反應(yīng)速率非常大，E0>400 kJ/mol，反應(yīng)速率非常小。從表5可知，在常規(guī)儲(chǔ)存狀態(tài)下沙棘果黃酮、多糖的降解活化能Ea值黃酮<多糖，說(shuō)明儲(chǔ)存時(shí)間可以對(duì)黃酮、多糖的降解起到保護(hù)作用，但儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)多糖的影響比黃酮的影響大一些。

2.4.3 動(dòng)力學(xué)模型的建立及驗(yàn)證

在不同儲(chǔ)存時(shí)間沙棘果黃酮、多糖質(zhì)量濃度的變化，將式（2）兩邊取對(duì)數(shù)后和式（4）可得到在不同儲(chǔ)存時(shí)間黃酮、多糖降解一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，即：

活化能Ea、指前因子A和R=8.314 J/(mol·K)代入上式可得不同儲(chǔ)存條件下沙棘果黃酮、多糖降解一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型：

表6 沙棘果在不同儲(chǔ)存條件下黃酮、多糖降解動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證Table 6 Validation of degradation-kinetic models of flavonoid and polysaccharide of seabuckthorn fruit under different storage conditions

式（5）為沙棘果在儲(chǔ)存時(shí)間為0 d的降解動(dòng)力學(xué)模型，式（6）為沙棘果在儲(chǔ)存時(shí)間5 d時(shí)的降解動(dòng)力學(xué)模型，通過(guò)上式計(jì)算的沙棘果黃酮、多糖的初始量和殘留量估算貯藏期。

對(duì)表6中的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行相關(guān)性分析，儲(chǔ)存時(shí)間為0 d預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的決定系數(shù)為0.85，儲(chǔ)存時(shí)間為5 d預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的決定系數(shù)為3.61，儲(chǔ)存時(shí)間為10 d的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的決定系數(shù)為0.8，表明所建立的儲(chǔ)存時(shí)間降解一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型有效，為預(yù)測(cè)沙棘果在不同貯藏條件黃酮、多糖的降解提供理論指導(dǎo)。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，采用響應(yīng)面法對(duì)沙棘果黃酮和多糖的降解率進(jìn)行優(yōu)化，建立降解回歸模型，最優(yōu)降解條件為黃酮：儲(chǔ)存時(shí)間10 d、超聲時(shí)間114.50 min、提取溫度73.60 ℃；多糖：儲(chǔ)存時(shí)間10 d、超聲時(shí)間115.60 min、提取溫度74.51 ℃。在此條件下，黃酮、多糖的降解率分別為70.11%，67.30%；與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近，擬合性良好，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

3.2 為揭示環(huán)境對(duì)沙棘果有效成分的影響規(guī)律，研究了不同儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)沙棘果黃酮、多糖含量的穩(wěn)定性和有效期；并進(jìn)行降解動(dòng)力學(xué)研究。沙棘果黃酮、多糖在不同儲(chǔ)存時(shí)間的降解均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。通過(guò)對(duì)黃酮、多糖降解動(dòng)力學(xué)的研究，為食品、中藥類(lèi)的儲(chǔ)藏、加工及開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。