孫世鑫，李科，駱鵬飛，俞蘭秀，莫小葉，孫海燕，張麗君，劉冬

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，深圳市發(fā)酵精制檢測(cè)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518055）

（2.綠雪生物工程（深圳）有限公司，廣東深圳 518055）

γ-氨基丁酸，又名γ-氨酪酸、4-氨基丁酸，是一種在自然界廣泛存在的小分子量非蛋白質(zhì)氨基酸。GABA是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，具有改善睡眠[2]、降低血壓[3]、緩解焦慮[4]和免疫調(diào)節(jié)[5]等多種生理功能。研究表明，健康人群體內(nèi)產(chǎn)生的GABA 能夠滿足自身需要，但受到年齡增長(zhǎng)或失眠、抑郁等亞健康狀態(tài)的影響，體內(nèi)的GABA 會(huì)因?yàn)檫^(guò)度消耗導(dǎo)致含量明顯下降[6]。2009 年，我國(guó)將GABA納入新資源食品目錄。開(kāi)發(fā)富含GABA 的功能性食品，能夠有效緩解和預(yù)防因體內(nèi)GABA 減少而誘發(fā)的各種慢性疾病和亞健康癥狀，因而具備良好的市場(chǎng)前景。

目前，GABA 可通過(guò)化學(xué)合成[7]、天然植物提取[8]和微生物發(fā)酵等方法制備。但化學(xué)合成法的產(chǎn)物在安全性上存在爭(zhēng)議，尚不能應(yīng)用于食品領(lǐng)域。天然物植物提取法受到原料、工藝等因素限制，提取分離產(chǎn)率低，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。相比之下，利用微生物如乳酸菌發(fā)酵，依靠其體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15）將L-谷氨酸經(jīng)α-脫羧反應(yīng)生成GABA，具有合成速度快、生產(chǎn)成本低、發(fā)酵產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[9]，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于富含GABA 的食品和藥品的合成[10]。

以酸奶為代表的發(fā)酵乳制品一直深受消費(fèi)者歡迎，乳酸菌作為益生菌也被廣泛應(yīng)用于酸奶生產(chǎn)中。但迄今為止，利用乳基底物培養(yǎng)食品安全級(jí)的產(chǎn)GABA 乳酸菌，并直接用于發(fā)酵生產(chǎn)富含GABA 的酸奶的研究報(bào)道鮮見(jiàn)，也尚未見(jiàn)到國(guó)內(nèi)外有富含GABA的酸奶上市的報(bào)道。因此，篩選適宜在乳基底物中生長(zhǎng)并具備高產(chǎn)GABA 能力的乳酸菌具有巨大的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

本研究從國(guó)內(nèi)市售發(fā)酵食品中分離篩選具備合成GABA 能力的食品安全級(jí)乳酸菌，得到1 株在乳基底物中具備高產(chǎn)GABA 潛力的菌株，并對(duì)其菌株特性進(jìn)行了初步研究，以期為富含GABA 的酸奶開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)選用國(guó)內(nèi)市售奶酪、奶疙瘩和米糟等發(fā)酵食品作為菌種分離原料。

1.2 培養(yǎng)基

MRS 肉湯培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉粉5，酵母粉5，硫酸鎂0.1，醋酸鈉5，檸檬酸銨2，磷酸氫二鉀2，硫酸錳0.05，吐溫80 1 mL，調(diào)節(jié)pH 值為7.2±0.1，121 ℃滅菌15 min。

M17 肉湯培養(yǎng)基（g/L）：大豆胨5，肉胨2.5，酪胨2.5，酵母粉2.5，牛肉浸粉5，乳糖5，抗壞血酸0.5，甘油磷酸鈉19，硫酸鎂0.25，調(diào)節(jié)pH值為7.2±0.1，121 ℃滅菌15 min。

MRS 平板培養(yǎng)基：在MRS 肉湯培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。

MI7 平板培養(yǎng)基：在M17 肉湯培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。

乳基底物培養(yǎng)基：市售脫脂乳粉，純水溶解后配置成10%（m/V）的復(fù)原乳，添加L-谷氨酸鈉（L-Glu-Na）2 g/L[11]。

1.3 試劑

GABA（色譜純），Sigma 公司；四氫呋喃、甲醇、乙腈（色譜純），天津大茂化學(xué)試劑廠；L-Glu-Na（生化試劑純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；革蘭氏染色液試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；API 試劑盒，法國(guó)梅里埃公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器與設(shè)備

5810R 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendoff 公司；LC-20AT 型高效液相色譜，日本Shimadzu 公司；Spectra Max M2 型熒光酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；ECLIPSE TS100 型倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.5 方法

1.5.1 菌株的分離純化與培養(yǎng)

對(duì)原料進(jìn)行前處理后，取樣品10 mL，用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋后涂布于MRS 平板培養(yǎng)基上，靜置于37 ℃和30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h，隨后挑選生長(zhǎng)較快、肉眼可見(jiàn)的菌落在MRS 平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)操作直至分離出形態(tài)一致的單菌落。對(duì)上述單菌落進(jìn)行鏡檢、革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。將革蘭氏染色呈陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)呈陰性的菌落純化后接種于適宜的肉湯培養(yǎng)基（乳桿菌-MRS培養(yǎng)基，乳球菌-M17 培養(yǎng)基）中靜置培養(yǎng)24 h。分別吸取等體積的菌懸液和40%（V/V）滅菌甘油于2 mL凍存管，搖勻，-80 ℃凍存。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

16S rDNA 序列委托深圳華大基因科技有限公司測(cè)定。測(cè)序引物 27F 和 1492R 分別為：27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R TACGGYTA CCTTGTTACGACTT。PCR 反應(yīng)體系（總體積30 μL）：無(wú)菌超純水17.8 μL，Buffer 3 μL，d NTP 2 μL，正向引物3 μL，反向引物3 μL，DNA 模板1 μL，酶0.2 μL。

PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35 次；最后72 ℃延伸10 min。將測(cè)序結(jié)果與NCBI 中Gene Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 對(duì)比，采用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5.3 產(chǎn)GABA 菌株的初篩和復(fù)篩

將菌株菌懸液以3%（V/V）體積分?jǐn)?shù)接種于適宜的肉湯培養(yǎng)基（乳桿菌：MRS 肉湯培養(yǎng)基；乳球菌：M17 肉湯培養(yǎng)基）中，于該菌最適生長(zhǎng)溫度下恒溫培養(yǎng)12 h，重復(fù)活化3 次。取單菌株種子液以3%（V/V）體積分?jǐn)?shù)接種于適宜的肉湯培養(yǎng)基（同上）中，于最適生長(zhǎng)溫度下恒溫培養(yǎng)72 h。取菌懸液1 mL 于4 ℃、12000 r/min 離心3 min，吸取適量上清液加入等體積5%（m/V）三氯乙酸溶液，再次于4 ℃、12000 r/min離心15 min。測(cè)定上清液中GABA 含量，并以其為指標(biāo)初篩出具備合成GABA 能力的菌株。

從初篩的菌株中選擇產(chǎn)量相對(duì)較高的菌株，按初篩方法接種于乳基底物培養(yǎng)基，于最適生長(zhǎng)溫度下恒溫發(fā)酵48 h，按初篩方法測(cè)定發(fā)酵乳中GABA 含量，并以其為指標(biāo)復(fù)篩出具備高產(chǎn)GABA 能力的菌株。

1.5.4 GABA 的定量檢測(cè)

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elutionprogram

HPLC 法，在QB/T 4587-2013 檢測(cè)方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。精密吸取適量樣品液與等體積的鄰苯二甲醛衍生劑混合，室溫反應(yīng)2 min 后經(jīng)0.22 μm 尼龍針頭過(guò)濾器轉(zhuǎn)移至液相進(jìn)樣瓶。流動(dòng)相A 為25 mmol/L 醋酸鈉，調(diào)節(jié)pH 至7.2；流動(dòng)相B 為甲醇和乙腈，混合比例為50:50，兩相均經(jīng)0.45 μm 有機(jī)系濾膜抽濾后超聲脫氣20 min 后使用。色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，梯度洗脫。

圖1 GABA 標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線Fig.1 The standard curve of GABA

用質(zhì)量濃度為10、50、100、150、250 μg/mL 的GABA 標(biāo)準(zhǔn)工作液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示。以峰面積(y)對(duì)GABA 濃度(x)做線性回歸，得線性回歸方程y=14179x-59007，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

1.5.5 菌株特性測(cè)定

1.5.5.1 形態(tài)學(xué)觀察

取菌液0.1 mL 涂布于平板培養(yǎng)基，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，觀察、記錄菌落顏色、大小、邊緣生長(zhǎng)情況。取少量經(jīng)革蘭氏染色后用顯微鏡于100 倍油鏡觀察并拍照，記錄其菌體形態(tài)特征。

1.5.5.2 糖代謝特性分析

將菌株于30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h 后，選取API 50 CH試驗(yàn)條，按照試驗(yàn)條的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，對(duì)菌株的糖代謝特性進(jìn)行分析。

1.5.5.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

比濁法[12]。將菌株接種于M17 肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，每隔2 h 使用酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)酵液在600 nm 下的吸光度（即OD600值），并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.5.5.4 產(chǎn)酸曲線測(cè)定

pH 計(jì)法[13]。將菌株接種于M17 肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，每隔4 h 測(cè)定發(fā)酵液pH 值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH 值為縱坐標(biāo)，繪制菌株產(chǎn)酸曲線。

1.5.5.5 耐酸能力測(cè)定

將菌株分別接種于pH 值為2.0、3.0、4.0 的M17肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)3 h，而后對(duì)不同pH 值培養(yǎng)基中的活性乳酸菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[14]，按式（1）計(jì)算菌株在不同pH 值下的存活率，測(cè)定菌株的耐酸能力。

1.5.5.6 耐膽鹽能力測(cè)定

菌株分別接種于膽鹽濃度為1.0、2.0、3.0 g/L 的肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)3 h，而后對(duì)不同膽鹽濃度培養(yǎng)基中的活性乳酸菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[15]，按式（2）計(jì)算菌株在不同膽鹽濃度下的存活率，測(cè)定菌株的耐膽鹽能力。

1.5.5.7 自凝聚能力測(cè)定

取菌種菌懸液1 mL，在4 ℃下以4000 r/min 離心5 min，棄上清液，收集菌體，再用pH 值7.0 的磷酸鹽緩沖液重復(fù)洗滌菌體兩次，使菌體重懸于1 mL 磷酸鹽緩沖液中。分別測(cè)定在30 ℃下靜置2、4、24 h后上層懸液的OD600值，按式（3）計(jì)算菌株的自凝聚能力[16]。

式中：A0為t=0 時(shí)刻的OD600值；At為t 時(shí)刻的OD600值。

1.5.5.8 表面疏水性測(cè)定

取菌種菌懸液3 mL，在4 ℃下以4000 r/min 離心5 min，棄上清液，收集菌體，再用pH 值7.0 的磷酸鹽緩沖液重復(fù)洗滌菌體兩次，使菌體重懸于3 mL 磷酸鹽緩沖液中。分別吸取1 mL 的乙酸乙酯及1 mL 的氯仿與上述磷酸鹽緩沖液混合，室溫靜置分層15 min，測(cè)定水相的OD600值，按式（4）計(jì)算菌株的表面疏水性[17]。

式中：A0為溶劑萃取前水相t=0 時(shí)刻的OD600值；At為溶劑萃取后水相t=15 min 時(shí)刻的OD600值。

1.5.6 數(shù)據(jù)處理與分析

每次實(shí)驗(yàn)均做3 次平行，數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SD表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性用SPSS 22.0 軟件中one-way ANOVA 法檢驗(yàn)，p＜0.05 視為有顯著差異，并用GraphPad Prism 8 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

表2 菌株的種屬分類鑒定Table 2 Classification and identification of strains

從原料中共分離純化出菌株171 株，經(jīng)深圳華大基因科技有限公司16S rDNA 測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定，全部為乳酸菌，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。所有待測(cè)菌株與對(duì)照菌株的同源性均在99%以上，其中基于一株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2 所示。

2.2 具備高產(chǎn)GABA 能力菌株的篩選

利用改進(jìn)后的HPLC法測(cè)定171株菌株發(fā)酵液中GABA 的質(zhì)量濃度，對(duì)菌株進(jìn)行初篩。得到具備GABA 合成能力的菌株74 株，其中乳桿菌2 種共41株，乳球菌3 種共33 株。經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)，不同種屬的乳酸菌的GABA 合成能力存在顯著差異。初篩中GABA 產(chǎn)量高于0.01 g/L 的17 株乳酸菌及其產(chǎn)量如表3 所示。

圖2 基于一株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic treeconstructed based onstrain of Lactococcus lactis subsp. lactis

表3 初篩中具備較高GABA 合成能力的菌株Table 3 Strains with relatively high yield of GABA in preliminary screening

表4 復(fù)篩中菌株GABA 產(chǎn)量情況Table 4 GABA production of strainsin rescreening

從上表可以發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌的GABA 合成能力相對(duì)突出。但目前短乳桿菌尚未列入我國(guó)《可用于食品的菌種名單》，不能滿足食品安全要求，故將短乳桿菌剔除。將剩余的12株乳酸菌轉(zhuǎn)接于乳基底物培養(yǎng)基中,于最適溫度下恒溫發(fā)酵48 h，并以發(fā)酵乳中GABA 含量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表4 所示。

由上表可見(jiàn)，編號(hào)為4043 的乳酸乳球菌乳酸亞種菌株（以下簡(jiǎn)稱4043 號(hào)菌株）在乳基底物中合成GABA 的能力最強(qiáng)，產(chǎn)量約為0.39 g/L。賢乾隆等[18]從酸菜和酸奶中分離得到干酪乳桿菌QL-20，按3%（V/V）接種至含L-Glu-Na 0.2%（m/V）的12%（m/V）的脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置發(fā)酵，凝乳時(shí)間為6 h，發(fā)酵乳中GABA 產(chǎn)量約0.09 g/L。Nejati F 等[19]用添加了5 g/L 酵母膏和20 mmol/L 谷氨酸鈉的滅菌煉乳培養(yǎng)乳酸乳球菌 DIBCA1（Lactococcus lactisDIBCA1）和植物乳桿菌PU11（L. plantarumPU11），在37 ℃下復(fù)配發(fā)酵48 h，GABA 的產(chǎn)量超過(guò)了0.14 g/L。

表5 4043 號(hào)菌株API 50CH 試驗(yàn)條代謝結(jié)果Table 5 Metabolism results of strain No. 4043 with API 50CH reagent strip

趙樹(shù)平等[20]從酸馬奶中篩選的瑞士乳桿菌ND01（L.helveticusND01），按3%（V/V）接種于11%（m/V）的滅菌復(fù)原乳中，于37 ℃下靜置發(fā)酵30 h，GABA產(chǎn)量最高近0.17 g/L。Wu QL 等[21]利用嗜熱鏈球菌YI-B1（Streptococcus thermophilusYI-B1）復(fù)配短乳桿菌NPS-QW-145（Lactobacillus brevisNPS-QW-145），于37 ℃下在添加2 g/L L-Glu-Na 的10%（m/V）脫脂乳中發(fā)酵24 h，GABA 的產(chǎn)量達(dá)到0.31 g/L。此外，閆天文等[22]將分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的植物乳桿菌NDC75017（L. plantarumNDC75017）與德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌混合（L. P:L. b:S.t=0.5:0.5:1.5）作為發(fā)酵劑，當(dāng)接種量為2%（V/V），L-Glu-Na 添加濃度為75 mmol/L，輔酶濃度為20 μmol/L，發(fā)酵溫度為43 ℃時(shí)，GABA 產(chǎn)量最高可達(dá)550 mg/kg。謝芳等[23]利用從生水牛乳中分離出的乳酸乳球菌乳酸亞種按照1:0.5:1 的比例復(fù)配德氏乳桿菌保加利亞亞種（1.2717Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（1.2718Streptococcus thermophilus），當(dāng)乳酸乳球菌接種量為3%（V/V）時(shí)，在L-Glu-Na添加量為6‰（m/V）的脫脂水牛乳中37 ℃恒溫發(fā)酵，GABA 產(chǎn)量最高可達(dá)0.7 g/L。而薛玉清等[24]將從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸奶中篩選的植物乳桿菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌按照0.5:0.5:1.5 的比例，總接種量為2%（V/V）接種至滅菌乳中，在43 ℃恒溫發(fā)酵3.6 h，GABA 產(chǎn)量超過(guò)了1.51 g/L?？梢?jiàn)，未經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化的4043 號(hào)菌株在乳基底物中單菌種發(fā)酵的GABA 產(chǎn)量明顯優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)量，但相較優(yōu)化后的多菌種復(fù)配發(fā)酵的產(chǎn)量還有一定距離，后期可通過(guò)多菌種混合發(fā)酵及條件優(yōu)化進(jìn)一步提升自身GABA 產(chǎn)量。

2.3 4043 號(hào)菌株的菌株特性

2.3.1 形態(tài)學(xué)特性

4043 號(hào)菌株的平板菌落及菌株的鏡檢結(jié)果如圖3所示。由圖可知，菌落為半透明乳白色，呈不規(guī)則圓形，直徑在1 mm 左右，中央略微隆起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊。菌體呈球形或卵圓形。

圖3 4043 號(hào)菌株的菌落及菌體形態(tài)Fig.3 Colony and morphological characteristics of strain No.4043

2.3.2 糖代謝特性

采用API 50CH 試驗(yàn)條對(duì)4043 號(hào)菌株的糖代謝特性進(jìn)行測(cè)定，各底物試驗(yàn)條代謝結(jié)果判別見(jiàn)表5。

可見(jiàn)，4043 號(hào)菌株可發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、蔗糖和海藻糖等18 種單糖、二糖及多糖，不能代謝山梨糖、蜜二糖、山梨醇等31 種底物，后續(xù)在針對(duì)4043 號(hào)菌株開(kāi)展的產(chǎn)品配方和發(fā)酵工藝優(yōu)化過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)該菌種的糖代謝特征選擇合適的糖類。

2.3.3 菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸曲線

4043 號(hào)菌株在30 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h 的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線如圖4 所示。由圖4 OD600曲線可知，總菌數(shù)在接種后0～2 h 顯著增加，在2～8 h 內(nèi)呈指數(shù)增加，8～12 h 緩慢增加并在13 h 附近到達(dá)峰值，隨后緩慢波動(dòng)，自32 h 后開(kāi)始顯著下降，直至發(fā)酵終點(diǎn)。這表明4043 號(hào)菌株適應(yīng)期較短；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為接種后2～8 h，菌株繁殖迅速；8～32 h 為穩(wěn)定期，能夠維持基本的生長(zhǎng)能力；自32 h 后進(jìn)入衰亡期。

圖4 4043 號(hào)菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸曲線Fig.4 Growth and acid production curve of strain No.4043

由圖4 中pH 值曲線可知，4043 號(hào)菌株在適應(yīng)期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)產(chǎn)酸迅速，導(dǎo)致發(fā)酵液pH 值自7.2迅速降低至5.5 左右，但其后pH 值便穩(wěn)定于此，直至發(fā)酵結(jié)束也未能進(jìn)一步降低。這表明4043 號(hào)菌株的持續(xù)產(chǎn)酸能力較弱，容易導(dǎo)致發(fā)酵乳的凝乳形態(tài)不佳。此外有研究表明，對(duì)于乳酸乳球菌乳酸亞種而言，菌株GAD 的最適pH 值在4.7 左右[25]。較高的終點(diǎn)pH值也不利于自身GAD 活性的充分發(fā)揮，從而限制了GABA 產(chǎn)量的進(jìn)一步增長(zhǎng)。因此在應(yīng)用于富含GABA的酸奶生產(chǎn)時(shí)，可復(fù)配具備較強(qiáng)持續(xù)產(chǎn)酸能力的菌種與4043 號(hào)菌株進(jìn)行混合發(fā)酵，以進(jìn)一步降低環(huán)境pH值，改善終點(diǎn)凝乳形態(tài)，提升GABA 產(chǎn)量。

2.3.4 菌株對(duì)酸和膽鹽的耐受性

能夠順利通過(guò)胃酸和膽鹽所構(gòu)成的生物屏障，并穩(wěn)定粘附于腸道上皮細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)定植，是益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生功能的前提條件[26]。因此，能夠在胃腸道中發(fā)揮作用的益生乳酸菌必須擁有較強(qiáng)的對(duì)酸和膽鹽的耐受性。4043 號(hào)菌株在不同pH 值和膽鹽濃度下的耐受情況如圖5 所示。由5a 圖可知，4043 號(hào)菌株對(duì)酸的耐受性隨pH 值變化差異顯著。于30 ℃下在pH 值為2.0 的M17 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h 后，菌株存活率幾乎為零。隨著pH 值上升，4043 號(hào)菌株的存活率也顯著上升。當(dāng)pH 值＞3 時(shí)，存活率明顯高于60%。結(jié)合其生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線可知，在pH 值3～5.5 的條件下，4043 號(hào)菌株對(duì)酸具備較強(qiáng)的耐受性。由5b圖可知，當(dāng)培養(yǎng)基中膽鹽濃度≥1 g/L 時(shí)，在30 ℃下靜置培養(yǎng)3 h 后，菌株基本無(wú)法存活，對(duì)膽鹽的耐受性極差。

圖5 4043 號(hào)菌株的耐酸和耐膽鹽特性Fig.5 Acid and bile salttolerance ability of strain No.4043

研究表明，健康人群胃腸道中，胃液pH 值和腸液膽鹽濃度都是動(dòng)態(tài)變化的。在進(jìn)食狀態(tài)下，胃部pH值在1.8～5.0之間波動(dòng)，通常情況下維持在2.0左右[27]，而腸液膽鹽濃度在3～5 g/L 之間變化[28]。結(jié)合4043 號(hào)菌株對(duì)酸和膽鹽的耐受范圍可知，該菌無(wú)法在健康人群的胃腸道環(huán)境中存活，不適宜在胃腸道內(nèi)定植以發(fā)揮益生菌功能，但仍可在發(fā)酵制備富含GABA 酸奶的過(guò)程中充分發(fā)揮其高產(chǎn)GABA 的潛力。

2.3.5 菌株的自凝聚能力和表面疏水性

研究顯示，自凝聚特性有助于乳酸菌形成生物膜，表面疏水性是決定乳酸菌非特異性粘附的重要?jiǎng)恿?，兩者?duì)于乳酸菌向腸道上皮細(xì)胞的順利粘附和穩(wěn)固定植至關(guān)重要[29]。4043 號(hào)菌株的自凝聚能力及表面疏水性如圖6 所示。從6a 圖可以發(fā)現(xiàn)，4043 號(hào)菌株的自凝聚力隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈非線性增加趨勢(shì)。在靜置2～4 h期間，4043 號(hào)菌株自凝聚力有所增加但差異不大，至24 h 后則迅速增加至72.77%，略優(yōu)于夏海燕等[30]篩選的發(fā)酵乳桿菌18-2（70.50%）和17-1（70.67%）。

從6b 圖可以發(fā)現(xiàn)，4043 號(hào)菌株對(duì)乙酸乙酯的疏水性明顯高于對(duì)氯仿的疏水性，但兩者數(shù)值均低于8%。參照表6 可判定，4043 號(hào)菌株為弱疏水性菌株，粘附特性較差。雖然具備良好的自凝聚力，但低疏水性的菌體表面決定了4043 號(hào)菌株難以在人體腸道內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效粘附與定植。這再次印證，4043 號(hào)菌株不適宜在胃腸道內(nèi)定植以發(fā)揮益生菌功能。

圖6 4043 號(hào)菌株的自凝聚能力和表面疏水性Fig.6 Auto-aggregationand hydrophobicity of strain No.4043

表6 菌株疏水性判定標(biāo)準(zhǔn)Table 6 Judgement standard of hydrophobicity

3 結(jié)論

3.1 本研究針對(duì)從市售發(fā)酵食品中分離出的171株乳酸菌，經(jīng)肉湯培養(yǎng)基初篩和脫脂復(fù)原乳培養(yǎng)基復(fù)篩，最終得到一株在乳基底物中具有高產(chǎn)GABA 潛力的食品安全級(jí)乳酸乳球菌乳酸亞種菌株。將該菌以3%（V/V）接種于含L-Glu-Na 2 g/L 的10%（m/V）乳基底物培養(yǎng)基中，在30 ℃下單菌種發(fā)酵48 h，GABA產(chǎn)量約0.39 g/L。

3.2 所篩的乳酸乳球菌乳酸亞種菌株能夠代謝葡萄糖、半乳糖等18 種糖分。于30 ℃下接種于M17 培養(yǎng)基中，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2～8 h。該菌持續(xù)產(chǎn)酸能力較弱，在pH 值3～5.5 的環(huán)境中具備良好的酸耐受性，菌株自凝聚力良好，但對(duì)膽鹽的耐受性極差，且屬于弱疏水性菌株，粘附特性較差，難以在人體腸道內(nèi)有效粘附與定植，不適宜在胃腸道內(nèi)定植以發(fā)揮其益生菌功能。

3.3 該菌種具有較高的產(chǎn)GABA 能力，可作為研制富含GABA 酸奶的潛力菌種應(yīng)用于富含GABA 功能性酸奶的生產(chǎn)中。