朱曉麗，楊周潔，文安燕，秦禮康

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）（2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

益生菌（probiotics），作為改善寄主腸道微生態(tài)作用的活性微生物[1]，具有增強(qiáng)免疫力[2]、降低膽固醇和延緩衰老[3]等作用。酸奶具有良好的生理功能和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是開發(fā)功能性食品的理想選擇[4]。含有益生菌的酸奶有改善胃腸道[5]和降血脂[6]功效。益生菌產(chǎn)品以乳制品為主，益生菌發(fā)酵的酸奶將益生菌本身的發(fā)酵性能與酸奶的保健功效結(jié)合達(dá)到協(xié)同作用[7]。益生菌乳制品主要有發(fā)酵乳、乳酸菌飲料、干酪、酸奶、乳飲料、奶粉和冰淇淋等等[8]，酸奶產(chǎn)品中益生菌的添加為消費(fèi)者提供了有益的功能[9]。

薏苡（Coixlacryma-jobiL.）為禾本科玉蜀黍族薏苡屬，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”，其成熟種仁稱為“薏米”[10]。薏米富含蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、礦物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，以及薏仁酯、薏仁油、三萜、谷甾醇、生物堿等活性成分，薏米有降壓、降糖、消炎、抑制癌細(xì)胞增殖等生理功能[11]。薏米被應(yīng)用于各種功能保健食品，研究發(fā)現(xiàn)，薏米漿與鮮奶發(fā)酵后，營(yíng)養(yǎng)成分更豐富，口味更好[12]。

目前，市售的酸奶大多采用Lactobacillus bulgaricus和Streptococcus thermophilu發(fā)酵，但它們耐酸耐膽鹽及粘附定殖效果較差，有益作用受到限制[13]。Lactobacillus reuteri作為益生菌已經(jīng)被我國(guó)批準(zhǔn)可用于乳制品、保健食品[5]，它有止瀉[14]、增強(qiáng)機(jī)體免疫[15]、拮抗病原微生物[16]和調(diào)節(jié)腸道菌群[17]等功能。同時(shí)，Lactobacillus reuteri耐酸耐堿能力較強(qiáng)，為其在腸道內(nèi)定殖并發(fā)揮益生功能創(chuàng)造必要條件[13]。從前期實(shí)驗(yàn)對(duì)適合羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)的功能谷物的篩選得出，薏米能顯著促進(jìn)Lactobacillus reuteri的生長(zhǎng)，活菌數(shù)量級(jí)高達(dá)1013cfu/mL，羅伊氏乳桿菌單菌株發(fā)酵存在凝乳效果差的缺點(diǎn)。因此，本文采用Lactobacillus reuteri分別與Streptococcus thermophilus和Lactobacillus bulgaricus協(xié)同發(fā)酵制備薏米酸奶，剖析其理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)特性、滋味及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以期為L(zhǎng)actobacillus reuteri的應(yīng)用及薏米產(chǎn)品的深入研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lactobacillus reuteri（保藏號(hào)BNCC No：186563）購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；Streptococcus thermophilus（保藏號(hào)CICC No：6247）購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；Lactobacillus bulgaricus（保藏號(hào)GDMCCNo：1.155）購(gòu)于廣東省微生物保藏中心；薏米、鮮牛奶、白砂糖均市售，MS 培養(yǎng)基、MS 肉湯培養(yǎng)基、酚酞、氫氧化鈉、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、磷酸、磷酸二氫鉀等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Pegasus HRT 4D Plus（LECO，USA）全二維氣相-高通量高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀；1260 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；TS-500Z 電子舌味覺分析系統(tǒng)，日本Insent 公司；TMS-Pro 質(zhì)構(gòu)分析儀，美國(guó)Food Technology Corporation 公司；JK9870 全自動(dòng)凱氏定氮儀；pH-25 型pH 計(jì)，上海今邁儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薏米酸奶的制備

以1:5 的料液比加入純凈水浸泡薏米24 h，煮1.5 h，打漿，加0.3%（中溫）α-淀粉酶，55 ℃糊化1 h，加入0.5%糖化酶58 ℃糖化50 min，120 目尼龍布過(guò)濾。6%白砂糖、薏米漿30%、鮮牛奶混合均質(zhì)。95 ℃下滅菌5 min，冷卻，接入5% 1:1:1 的菌種，41 ℃發(fā)酵6 h，酸奶于4 ℃冷藏24 h，得到薏米酸奶成品。

表1 樣品詳細(xì)信息Table 1 Sampledetails

表2 薏米酸奶理化指標(biāo)Table 2 Physical and chemical indexes of semen coicis yogurt

表3 薏米酸奶質(zhì)構(gòu)分析Table 3 Texture analysis of semen coicis yogurt

1.3.2 常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定

滴定酸度參照LIM[18]方法；持水率參考FENGC[19]方法；手持pH 計(jì)測(cè)定pH 值；活菌數(shù)的測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.3.3 TPA 測(cè)試

酸奶的質(zhì)構(gòu)測(cè)定參考FANG T[20]等的方法略作修改，測(cè)試采用連接25N 感應(yīng)元的質(zhì)構(gòu)儀，使用直徑為50 mm 探頭，測(cè)試速率60 mm/min、形變量30%。

1.3.4 有機(jī)酸測(cè)定

有機(jī)酸的測(cè)定參照王雪艷[21]等的方法略作修改。色譜條件：磷酸二氫鉀溶液（0.02 mol/L）；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

1.3.5 電子舌的測(cè)定分析

電子舌的測(cè)定分析參考王一然[22]的方法略作修改，取適量體積的酸奶5000 r/min 離心10 min，加2倍體積的超純水稀釋，取25 mL于電子舌專用杯測(cè)定。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定參MOINEAU-JEAN A[23]的方法略作修改，采用SPME-GC-MS 技術(shù)對(duì)酸奶進(jìn)行定性及定量分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0和Excel處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，Duncan 檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)

酸奶的pH 和滴定酸度取決于菌種種類、接菌比例和菌種產(chǎn)酸能力，酸度是衡量酸奶品質(zhì)的重要指標(biāo)[24]。由表2 可以看出，薏米酸奶pH 在4.04～4.43，滴定酸度在80.66～96.65 °T，而RTB 滴定酸度是80.66 °T，顯著低于其他兩菌發(fā)酵的酸奶（p＜0.05），這與溫夏萍[25]研究結(jié)論一致，Lactobacillusreuteri發(fā)酵乳糖主要產(chǎn)生乳酸、碳酸和乙酸，碳酸不穩(wěn)定易分解成二氧化碳揮發(fā)；薏米酸奶持水率在36.76%～44.80%，TB 的持水率為44.80%，顯著高于RTB、RT 和RB（p＜0.05）；RTB 中活菌數(shù)達(dá)到9.99 log cfu/mL，顯著高于2 株菌發(fā)酵的酸奶，這與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，薏米促進(jìn)Lactobacillus reuteri的生長(zhǎng)（p＜0.05）；薏米酸奶的蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著差異（p＜0.05）。

2.2 TPA

酸奶的硬度、彈性和內(nèi)聚性是評(píng)價(jià)其質(zhì)構(gòu)特性的重要指標(biāo)[26]。酸奶的凝乳結(jié)構(gòu)主要是由酪蛋白、脂肪和乳清三部分形成的三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)[22]。由表3 可知，RTB 酸奶咀嚼性（0.45 mj）、內(nèi)聚性（0.77 Ratio）、膠黏性（0.05 N）均顯著高于其他三個(gè)組，而硬度（0.69 N）、彈性（8.99 mj）顯著高于RT 和RB，略低于TB（p＜0.05），說(shuō)明3 株菌發(fā)酵賦予薏米酸奶柔和的口感，表明3 株菌發(fā)酵薏米酸奶的整體凝固性較好，較黏稠，符合凝固型酸奶質(zhì)構(gòu)特性。

2.3 有機(jī)酸成分分析

有機(jī)酸與發(fā)酵乳品質(zhì)緊密相關(guān)[27]。由表4 可知，RTB、RT、RB和TB中有機(jī)酸含量分別是14.27、15.08、14.92、21.04 mg/mL。TB 中乳酸、檸檬酸含量最高，RTB 中乙酸（0.79 mg/mL）含量顯著高于其它兩菌發(fā)酵的酸奶（p＜0.05），RB 中草酸（0.26 mg/mL）和酒石酸（0.84 mg/mL）含量最高。這與陳永福[28]研究結(jié)論一致，乳酸和檸檬酸是酸奶中的主要有機(jī)酸，酸奶的乳酸和檸檬酸與滴定酸度呈正相關(guān)，乙酸與滴定酸度呈負(fù)相關(guān)，這解釋了RTB 中滴定酸度低和pH 高的結(jié)果。

表4 薏米酸奶中有機(jī)酸分析（mg/mL）Table 4 Analysis of organic acids in semen coicis yogurt

2.4 電子舌

滋味是由酸、咸、鮮、甜、苦味組合而成，在酸奶中，這些人體能夠鑒別的基本味覺主要由酸奶中非揮發(fā)性物質(zhì)的組成及含量有關(guān)[29]。由圖1 可知，四個(gè)樣酸、甜、苦、鮮和咸味覺響應(yīng)值均存在差異，酸味差異性最大，其次是鮮、咸、苦、甜澀（p＜0.05），RTB甜味和鮮味最強(qiáng)，苦味、澀味和酸味最弱。

圖1 酸奶味感雷達(dá)圖Fig.1 Yogurt taste radar map

2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

圖2 薏米酸奶香氣成分GC-MS 分析總離子流色譜圖Fig.2 Chromatogram of total ion flow of semen coicis yogurt aroma components analyzed by gc-ms

醇、醛、酮、酸、脂等共同決定了酸奶的風(fēng)味[30]，風(fēng)味是決定酸奶的可接受性和選擇性的重要因素[31]。由表5 可知，RTB、RT、RB 和TB 檢測(cè)出總的風(fēng)味物質(zhì)依次為81 種（1331.74 ng/mL）、68 種（448.88 ng/mL）、73 種（388.74 ng/mL）和50 種（808.31 ng/mL），加入Lactobacillus reuteri提高了薏米酸奶的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量。

酸類物質(zhì)是酸奶重要的風(fēng)味物質(zhì)，主要表現(xiàn)在酸奶的滋味上，RTB、RT、RB 和TB 檢測(cè)出的酸分別為11 種（467.31 ng/mL）、10 種（224.58 ng/mL）、10 種（149.16 ng/mL）和8 種（263.06 ng/mL），酸奶樣品中檢測(cè)到含量較高的四種酸分別是辛酸、己酸、葵酸（87.52 和乙酸，且RTB 中辛酸（134.13 ng/mL）、己酸（100.42 ng/mL）、葵酸（87.52 ng/mL）和乙酸（84.67 ng/mL）顯著高于其它2 株菌發(fā)酵的酸奶（p＜0.05），RTB 中乙酸含量較高這與Vénica C I 研究一致，益生菌通過(guò)異發(fā)酵途徑生產(chǎn)乙酸有關(guān)[32]。癸酸能增加酸奶奶香味，己酸具有的椰果香味，戊酸表現(xiàn)出奶油香味，丁酸、庚酸具有奶酪香[33]。這些特殊的酸賦予了薏米酸奶獨(dú)特的味道。

醇類物質(zhì)的閾值較高，對(duì)酸奶風(fēng)味物質(zhì)的影響很小，但是醇可轉(zhuǎn)化為酸，也是必不可少的一類物質(zhì)。RTB、RT、RB 和TB 檢測(cè)出的醇依次為18 種（167.75 ng/mL）、11 種（108.16 ng/mL）、14 種（85.11 ng/mL）、10 種（104.09 ng/mL）。四個(gè)樣中含量較高的四種醇分別是乙醇（38.16 ng/mL）、2-壬醇（53.43 ng/mL）、2,3 丁二醇（28.65 ng/mL）和4-庚醇（11.70 ng/mL），2-壬醇和4-庚醇在RTB 中最高，乙醇和2,3 丁二醇在RT 中最高。

酮類物質(zhì)由多不飽和脂肪酸的氧化、熱降解，氨基酸降解或微生物代謝產(chǎn)生[34]。RTB、RT、RB 和TB檢測(cè)出的酮依次為14 種（599.11 ng/mL）、10 種（21.18 ng/mL）、9 種（51.86 ng/mL）、10 種（388.83 ng/mL）；酸奶在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，使酸奶具有特有的風(fēng)味，在所有風(fēng)味物質(zhì)中2-壬酮含量最高，為341.94 ng/mL，它能夠給酸奶提供獨(dú)有的清香味，RTB 中2-壬酮含量顯著高于其它兩菌發(fā)酵酸奶。3-羥基-2-丁酮具有濃郁的奶香味，在RTB 中含量最高，達(dá)到34.81 ng/mL；丁二酮具有濃郁的奶油味，在RTB中含量最高，達(dá)到3.34 ng/mL；2-庚酮有類似梨的水果香味，在RTB 中含量為111.62 ng/mL 顯著高于其它兩菌發(fā)酵酸奶。2,3-戊二酮具有奶油、焦糖香氣，并帶有堅(jiān)果香，只在RTB 中檢測(cè)到。

表5 薏米酸奶主要風(fēng)味物質(zhì)種類與含量分析Table 5 Main flavor substances and content analysis of semen coicis yogurt

烯烴類酮類36 11.15 甲酸己酯 - 3.68±0.04a - -37 11.76 辛酸甲酯 C9H18O2 - 0.28±0.02a - -38 12.36 辛酸乙酯 C10H20O2 0.02±0.01c 0.64±0.01a 0.16±0.01b -39 14.88 苯甲酸甲酯 C8H8O2 0.42±0.04d 1.23±0.01a 0.69±0.05c 0.81±0.01b 40 15.39 苯甲酸乙酯 C9H10O2 0.36±0.02a 0.15±0.01c 0.19±0.01b -41 15.85 丙烯酸異冰片酯 C13H20O2 0.23±0.04c 0.93±0.03a 0.45±0.03b -42 17.06 乙酸-5-十二烯醇酯 C14H26O2 - - - 5.37±0.11a 43 17.57 2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯 C16H30O4 0.54±0.01a - - 0.54±0.05a 44 17.67 2-甲基丙酸酯 C12H24O3 - - 0.14±0.01a -45 18.42 馬來(lái)酸二丁酯 C12H20O4 - 0.17±0.02a - -46 20.81 硬脂酸甲酯 C19H38O2 - - - 0.40±0.02a 47 20.81 棕櫚酸甲酯 C17H34O2 1.09±0.02a 0.71±0.01b 0.70±0.02b -48 20.86 丁位癸內(nèi)酯 C10H18O2 - 0.89±0a - -49 21.14 棕櫚酸乙酯 C18H36O2 39.61±0.79a 31.80±0.47b 22.56±0.31c 15.60±0.51d 50 22.35 酞酸二乙酯 C12H14O4 - 0.54±0.31a 0.07±0.00b -51 23.33 反油酸乙酯 C20H38O2 9.32±0.13a 6.74±0.16b 4.76±0.12c 2.64±0.07d小計(jì) 53.44±1.13a 49.38±1.30a 30.36±1.03b 25.41±1.13d 52 8.93 雙戊烯 C10H16 0.45±0.09a 0.19±0.01b - -53 9.94 苯乙烯 C8H8 0.49±0.10a 0.56±0.06a 0.37±0.02b 0.35±0.05b 54 12.68 2,4-二甲基苯乙烯 C10H12 - - 0.55±0.42a -55 13.46 氟乙烯 C2H3F - - 0.08±0.00a -小計(jì) 0.93±0.01a 0.76±0.01b 1.01±0.03a 0.35±0.05b 56 5.50 2,3-丁二酮 C4H6O2 3.34±0.11a 2.54±0.09b 2.01±0.07c 1.39±0.10d 57 5.50 2-戊酮 C5H10O 5.38±1.04a 58 6.73 2,3-戊二酮 C5H8O2 0.25±0.01a - - -59 8.23 3-庚酮 C7H14O - 0.14±0.00a 0.03±0.00b -60 8.72 2-庚酮 C7H14O 111.62±0.73a 4.66±0.04c 9.6±0.56c 54.33±1.11b 61 9.11 4-甲基-2-己酮 C7H14O 1.13±0.00a - - -62 9.84 5-甲基-3-庚酮 C8H16O - 0.17±0.01a - -63 10.36 3-羥基-2-丁酮 C4H8O2 34.81±1.58a 4.64±0.13c 4.45±0.12c 20.60±0.73b 64 11.40 2-羥基-3-戊酮 C5H10O2 0.42±0.01a - - -65 11.79 2-壬酮 C9H18O 341.94±3.11a 6.34±0.48d 24.01±0.67c 243.80±3.63b 66 14.47 甲基壬基甲酮 C11H22O 84.66±1.17a 3.29±0.03d 9.90±0.20c 47.38±1.05b 67 15.25 苯乙酮 C8H8O 0.53±0.01a 0.39±0.07b 0.24±0.05c 0.25±0.04c 68 16.85 2-十三烷酮 C13H26O 17.10±1.23a 0.87±0.03d 2.49±0.13c 9.54±0.45b 69 17.34 香葉基丙酮 C13H22O 0.68±0.05a - 0.14±0.02b -70 19.00 2-十五烷酮 C15H30O 2.74±0.23a - - -71 19.01 十七烷酮 C17H34O 0.12±0.01c 0.58±0.04b - 1.19±0.03a 72 23.25 2,6-二苯亞甲基環(huán)己酮C15H29NO3 1.60±0.02b - - 4.97±0.02a小計(jì) 599.11±4.18a 21.18±0.71d 51.86±1.31c 388.83±3.81b

注：“-”表示未檢出。

酯類物質(zhì)是酸奶的重要風(fēng)味物質(zhì)。酸奶酯類物質(zhì)主要通過(guò)脂肪酸水解以及微生物的代謝生成，特別是原料乳中的短鏈脂肪酸水解會(huì)產(chǎn)生甲基酮和內(nèi)酯，能夠直接影響酸奶的整體風(fēng)味。RTB、RT、RB 和TB中檢測(cè)出的脂為11 種（53.44 ng/mL）、14 種（49.38 ng/mL）、12 種（30.36 ng/mL）、6 種（25.41 ng/mL）。乙酯類化合物具有水果花香味，可減少酸奶的苦味和酸味[35]，在RTB 中含量最高，為50.73 ng/mL，這與前文RTB 中滴定酸度最低、有機(jī)酸含量最低和質(zhì)構(gòu)中苦味最弱結(jié)果一致。

醛類物質(zhì)是酸奶中重要的風(fēng)味物質(zhì)。RTB、RT、RB 和TB 中出的醛為6 種（14.18 ng/mL）、4 種（10.31 ng/mL）、7 種（36.21 ng/mL）、6 種（9.85 ng/mL）。壬醛會(huì)產(chǎn)生蠟香、蜂蜜香等，在RT 中含量最高，為4.21 ng/mL；癸醛微甜，有類似于甜橙油和玫瑰油的味道，散發(fā)出新鮮的柑橘皮的清香味，只在RTB 中檢測(cè)出。

綜上，3 株菌發(fā)酵酸奶的醇、酸、脂、酮都顯著高于其他2 株菌發(fā)酵的樣品，對(duì)3 株菌發(fā)酵酸奶貢獻(xiàn)性較大的是酮類、酸類，含量最大的四種物質(zhì)是2-壬酮（341.94 ng/mL）、2-庚酮（111.62 ng/mL）、辛酸（134.13 ng/mL）、己酸（100.42 ng/mL）。3 株菌發(fā)酵中的醇、酸、脂、酮等含量分布較為分散、合理，3株菌發(fā)酵提高了酸奶風(fēng)味物質(zhì)種類和含量，3 株菌發(fā)酵的酸奶風(fēng)味更均衡。

3 結(jié)論

3 株菌協(xié)同發(fā)酵顯著提高酸奶的活菌數(shù)（9.99 log cfu/mL）、咀嚼性（0.45 mj）、內(nèi)聚性（0.73 Ratio）、膠黏性（0.05 N）、乙酸含量（0.79 mg/mL）、甜味和鮮味味覺響應(yīng)值，顯著減弱酸奶的苦味、澀味、酸味味覺響應(yīng)值（p＜0.05）；3 株菌發(fā)酵酸奶的風(fēng)味物質(zhì)為81 種（1331.74 ng/mL），種類、含量顯著高于2 株菌發(fā)酵的酸奶，且其中的醇、酸、酸、酮含量都顯著高于兩菌發(fā)酵的樣品（p＜0.05）。3 株菌協(xié)同發(fā)酵薏米酸奶的整體凝固性較好、質(zhì)構(gòu)特性較好、滋味適中、風(fēng)味物質(zhì)種類較多和含量較高，并且酸奶具有薏米獨(dú)特的谷物香味，為L(zhǎng)actobacillus reuteri在乳制品中的應(yīng)用及薏米產(chǎn)品的深入研發(fā)提供理論依據(jù)。