王方華，劉思雨，魏瑞霞，楊博，王永華

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

（2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

磷脂酶D（PLD，EC 3.1.4.4）是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱。廣泛存在于高等動植物和細菌等多種生物體中。目前對于PLD 的研究多集中于陸地微生物，其中，放線菌中的鏈霉菌屬Streptomyces是研究者所關(guān)注的焦點[1]。PLD 作為一種重要的工具酶，在食品和醫(yī)藥行業(yè)中具有極大的應(yīng)用價值。在生物體內(nèi)，PLD 催化磷脂（PLs）水解所生成的磷脂酸（PA）是一種具有多種生物學(xué)功能的細胞內(nèi)脂質(zhì)分子。此外，PA 還是許多生物活性信使脂質(zhì)分子的前體物質(zhì)，其中包括二酰基甘油（DAG）和溶血磷脂酸（LPA）[1]。因此，PLD 催化磷脂水解反應(yīng)不僅在磷脂代謝中發(fā)揮重要作用，而且在諸如信號傳導(dǎo)、胞內(nèi)運輸、細胞凋亡、細胞膜重構(gòu)、囊泡運輸、細胞遷移、有絲分裂、內(nèi)吞作用、胞吐作用和細胞骨架重構(gòu)等許多細胞生命活動中也起著重要作用[2-4]。PLD 作為一種界面酶，其催化水解反應(yīng)在磷脂-水界面上進行[5]。在前期研究中，我們構(gòu)建了副溶血弧菌PLD（VpPLD）的失活型重組表達菌株（對催化活性位點進行單點突變H152A），從界面吸附角度對VpPLD 的N-末端（1～34 個氨基酸）和C-末端（434～487 個氨基酸）肽段對VpPLD 的界面吸附特性的影響進行了表征。研究發(fā)現(xiàn)，N-和C-末端相應(yīng)氨基酸的缺失會導(dǎo)致VpPLD 對各種磷脂單分子層的界面吸附特性發(fā)生改變[6]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)重組表達蛋白中(His)6-tag 的位置也會對酶蛋白的界面吸附性質(zhì)產(chǎn)生影響[6]。然而，關(guān)于(His)6-tag 和N/C-末端殘基對VpPLD 底物選擇性和基本酶學(xué)反應(yīng)特性的影響信息仍然缺乏。基于此，本文成功構(gòu)建了相應(yīng)的重組突變體并分別測定重組突變蛋白的水解活性和磷脂底物選擇性，為深入了解VpPLD 的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿（DMPC）、1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DMPE）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-(l"-rac-甘油)（DMPG）、1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷脂酰-L-絲氨酸（DMPS）、1,2-二月桂?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿（DLPC）、1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿（DPPC）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿（DSPC）、1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷脂酰膽堿（DOPC）、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿（DAPC）均購自Larodon 公司（瑞典，索爾納），純度＞98%。1,2-二辛基-sn-甘油-3-磷脂酰-對硝基苯酚（PpNP）參照D"Arrigo 等人（1995）[7]的方法合成。水楊酸鈉購自美國Sigma 公司；重組表達載體pET21a和pET28a 購自Stratagene（La Jolla，CA，USA）；大腸桿菌Shuffle T7 感受態(tài)細胞購自New England BioLabs（中國，北京）；IPTG（異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷）、卡那霉素和氨芐青霉素抗生素均購自生工生物工程股份有限公司（中國，上海）；Ni2+-NTA 層析柱和陰離子交換色譜柱（Q-Sepharose XL）購自GE Healthcare 公司（美國，波士頓）；50 ku 超濾管、BCA蛋白檢測試劑盒購自生工生物工程股份有限公司（中國，上海）；其它試劑均為分析純。

PCR 儀，東勝創(chuàng)新生物技術(shù)科技有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱HYG-C，江蘇太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；超聲波細胞破碎儀JY92-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白層析儀Biologic LP，Bio-Rad 公司；酶標(biāo)儀ELx800，BioTek 公司；微孔板恒溫震蕩器ST70-2，杭州米歐儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VpPLD-WT 及N-/C-端截短突變體大腸桿菌重組表達菌株構(gòu)建

本研究中來自副溶血弧菌的PLD 蛋白序列已收錄在了NCBI-蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，編號為EXJ48329.1。PLD 全長由505 個氨基酸組成，利用軟件Signalp 4.1預(yù)測蛋白序列中前 18 個氨基酸是其信號肽（MLHTLSKFIFAFMFSVLS）。根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性對編碼成熟蛋白的PLD 基因序列進行優(yōu)化，由生工生物技術(shù)公司進行全基因合成，命名為VpPLD-WT，其蛋白質(zhì)序列見圖1。在進行重組表達載體構(gòu)建過程中，為考察不同(His)6-tag 位置對于VpPLD 酶蛋白活性和底物選擇性的影響，分別將VpPLD-WT 導(dǎo)入重組表達載體pET21a 和pET28a 中，構(gòu)建pET21a-VpPLD-WT-(His)6(C-末端帶有(His)6-tag)或pET28a-(His)6-VpPLD-WT(N-末端帶有(His)6-tag)和pET28a-(His)6-VpPLD-WT-(His)6(N/C- 末端均帶有(His)6-tag)重組表達質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計用于進行末端截短突變體構(gòu)建的PCR 擴增引物（表1）。通過重疊延伸法分別以所構(gòu)建的pET21a-VpPLD-WT-(His)6或pET28a-(His)6-VpPLD-WT質(zhì)粒為模板進行截短突變，構(gòu)建相應(yīng)VpPLD 的N-末端（VpPLD-Δ1-34）和C-末端（VpPLD-Δ469-487 和VpPLD-Δ451-487）截短突變體，用限制性內(nèi)切酶DpnI 對PCR 擴增模板進行酶切，將酶切消化后PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。提取相應(yīng)的質(zhì)粒進行測序以驗證序列準確性。最后，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SHuffle T7 感受態(tài)細胞，構(gòu)建相應(yīng)的大腸桿菌重組表達菌株。

表1 磷脂酶VpPLD 突變體構(gòu)建所用引物序列Table 1 Primer sequences for theVpPLD mutants construction

1.2.2 VpPLD-WT 及截短突變重組蛋白的表達與純化

分別取上述構(gòu)建好的大腸桿菌重組蛋白表達菌株，以5%的接種量接種到5 mL Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（含有對應(yīng)的抗生素），37 ℃、200 r/min 條件培養(yǎng)過夜，制備發(fā)酵種子液。將制備獲得的種子液按10%接種量放大接種于3 L 含有相應(yīng)抗生素（0.05 mg/mL）的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 條件下繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm=0.8 時添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導(dǎo)，使其終濃度為0.2 mM。在20 ℃，200 r/min 條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h 后收集菌體。菌體重懸于600 mL 緩沖液A（50 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，5.0 mM 咪唑，pH 8.0）中，進行超聲破碎（超聲破碎時間15 min），將破碎液進行離心（10,000 r/min，20 min，4 ℃），收集上清液。將收集的濾液上樣至Ni2+-NTA 層析柱，用緩沖液A（50 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，5.0 mM 咪唑，pH 8.0）沖洗，去除雜蛋白。隨后用緩沖液B（50 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，200 mM 咪唑，pH 8.0）進行目的蛋白洗脫。將收集獲得的目的蛋白溶液繼續(xù)上樣至Q-Sepharose XL 柱，用緩沖液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 8.0）洗脫目的蛋白。采用50 ku 超濾管對洗脫目的蛋白進行濃縮和換鹽操作。利用12% SDS-PAGE 分析目的蛋白純度。利用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3 VpPLD-WT 及截短突變重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)表征

以1,2-二辛?；?sn-甘油-3-磷脂酰-對硝基苯酚（PpNP）作為水解底物，采用分光光度法分別測定野生型VpPLD及其突變體在不同pH值和溫度條件下的酶活力。將水解反應(yīng)底物PpNP 用無水乙醇進行溶解，配制終濃度為10 mM。酶活力測定反應(yīng)體系為：酶反應(yīng)在96 孔板中進行，取10 μL（10 mM）底物溶液加入到200 μL 酶蛋白溶液中；對照組以對應(yīng)pH 的緩沖液代替酶蛋白溶液。將96 微孔板置于微孔板恒溫震蕩器進行孵育，在30 ℃，200 r/min 條件下進行反應(yīng)，反應(yīng)一定時間后，加入100 μL 10% SDS 以終止反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測定405 nm 紫外吸收波長下樣品的吸光值，參照繪制的產(chǎn)物pNP 標(biāo)準曲線計算相應(yīng)條件下的酶活力（U/g）。本實驗中所用的緩沖液包括50 mM 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.0 和5.0）、50 mM 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0 和7.0）、50 mM Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）、50 mM 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.0 和10.0）。每組實驗設(shè)置三個平行組。1 個酶活力單位定義為在測定條件下每分鐘釋放1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量。

參考Dippe 和Ulbrich-Hofmann 所建立的PLD 檢測方法[8]，對VpPLD-WT 及截短突變體的磷脂底物選擇性進行表征。將相應(yīng)磷脂底物用氯仿進行溶解，配制成一定濃度的磷脂母液（50 mM）。母液經(jīng)氯仿進一步稀釋制備成工作液（1 mM），取出一定體積的磷脂溶液，經(jīng)氮氣吹干除去氯仿，并用10 mM Triton X-100重新進行溶解，經(jīng)超聲處理得到含有1 mM 終濃度磷脂的底物溶液。酶活力的具體測定方法和步驟如下：取配制的磷脂底物溶液10 μL 與70 μL 的酶液（酶蛋白溶于50 mM Tris-HCl，pH 8.0）混勻后加入96 微孔板中，將96 微孔板置于微孔板恒溫震蕩器進行反應(yīng)。對照組以50 mM Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）代替酶液，其它條件相同。分別設(shè)定不同的反應(yīng)溫度（20～45 ℃）條件，以200 r/min 速度震蕩反應(yīng)，反應(yīng)30 min 后，加入水楊酸鐵（FeSal）溶液（6.0 mM）200 μL 進行顯色，顯色5 min 后，用酶標(biāo)儀測定樣品在490 nm 紫外吸收波長下的吸光值。參照繪制的PA 標(biāo)準曲線計算水解生成的PA 的量從而計算得出酶活力。每組實驗設(shè)計三組平行。1 個酶活力單位定義為在測定條件下每分鐘釋放1 μmol PA 所需的酶量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測定三次，采用SPSS 13.0 軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)表示為“均值±標(biāo)準差”，用ANOVA 進行方差分析，采用Duncan 法進行均數(shù)間的多重比較（顯著性水平p＜0.05）。采用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 VpPLD-WT 蛋白序列分析

圖1 成熟VpPLD 蛋白序列Fig.1 Sequence information of mature VpPLD protein

VpPLD 序列全長由505 個氨基酸組成。其中，前18 個氨基酸（MLHTLSKFIFAFMFSVLS）被預(yù)測為信號肽，表明該蛋白在副溶血弧菌中為胞外分泌蛋白。在Swiss Institute of Bioinformatics 平臺上的ExPASy 分子生物服務(wù)網(wǎng)頁中，利用pI/Mw 計算工具，預(yù)測出的成熟VpPLD 蛋白的分子量和等電點分別約為55 ku 和5.35。在VpPLD 的蛋白序列中發(fā)現(xiàn)兩個高度保守的基序(HxK(x)4D(x)6G)，其中152 位組氨酸和386 位組氨酸被預(yù)測為活性氨基酸殘基（見圖1）。VpPLD 蛋白序列所含的高度保守HKD 基序表明此酶是PLD 超家族的成員。

2.2 (His)6-tag 位置對野生型VpPLD 酶學(xué)性質(zhì)的影響研究

2.2.1 (His)6-tag 位置對野生型VpPLD 的最適反應(yīng)pH 和溫度的影響

為研究(His)6-tag 對VpPLD 的酶學(xué)性質(zhì)的影響，本研究分別構(gòu)建了(His)6-tag 位于野生型VpPLD 的N-末端((His)6-VpPLD-WT)或C-末端(VpPLD-WT-(His)6)以及N/C-兩末端((His)6-VpPLD-WT-(His)6)的大腸桿菌表達菌株。通過SDS-PAGE 分析獲得了高純度的蛋白（圖2）。以PpNP 作為水解反應(yīng)底物，分別對所構(gòu)建的三種野生型VpPLD重組蛋白進行不同pH條件下的酶活力測定，繪制酶活力隨緩沖液pH 變化曲線。如圖3a 所示，分別得到了三條鐘形曲線。其中，(His)6-VpPLD-WT 在pH 值為7.0 時水解活性最高。而VpPLD-WT-(His)6在pH 值為8.0 時水解活性最高。對于(His)6-VpPLD-WT-(His)6，即使在pH 8.0 時活性顯示最高，但與pH 值為7.0 時的酶活力相比，無顯著性差異（p＞0.05）。當(dāng)反應(yīng)pH 值低于7.0 或大于8.0 時，這三種酶的活性均顯著降低。

以DOPC 為水解底物，采用分光光度度法分別測定了所構(gòu)建的三種野生型VpPLD 在不同反應(yīng)溫度條件下（20～45 ℃）的酶活力，繪制出酶活力隨溫度變化的曲線。如圖3b 所示，3 種野生型VpPLD 在30 ℃條件下均表現(xiàn)出最高的比活力。結(jié)果表明，(His)6-tag的位置不會對野生型VpPLD 重組蛋白的最適反應(yīng)溫度造成影響。

圖2 重組表達的野生型VpPLD 及其對應(yīng)截短突變蛋白的SDS-PAGE 結(jié)果Fig.2 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of the purified wild-type VpPLD and its corresponding truncated mutants

圖3 (His)6-tag 位置對野生型VpPLD 的最適pH(a)和溫度(b)的影響結(jié)果Fig.3 Location of (His)6-tag on the optimum reaction pH (a)and temperature (b) of wild-type VpPLD

2.2.2 (His)6-tag 位置對野生型VpPLD 的?；滈L選擇性的影響

在本研究中，選擇具有不同?；滈L度（12～20個碳）的磷脂酰膽堿作為水解底物，進一步分析比較不同野生型VpPLD 的?；滈L選擇性。結(jié)果表明：N-末端帶(His)6-tag 的VpPLD（(His)6-VpPLD-WT）和N/C-末端帶有(His)6-tag 的VpPLD((His)6-VpPLD-WT-(His)6)對不同?；滈L度磷脂酰膽堿的底物選擇性沒有顯著差異（p＞0.05）。而C-末端帶(His)6-tag 的VpPLD（VpPLD-WT-(His)6）則對不同?；滈L度的磷脂酰膽堿表現(xiàn)出選擇性差異（圖4a）。與其他?；滈L度的磷脂酰膽堿相比，發(fā)現(xiàn)VpPLD-WT-(His)6對DMPC（14:0），DSPC（18:0）和DOPC（18:1）的選擇性顯著提高（p＜0.05），相對應(yīng)的酶活力分別為7.55 U/g、6.47 U/g 和6.40 U/g。

通過對比三種野生型VpPLD 對不同磷脂的水解活力，發(fā)現(xiàn)N-末端帶(His)6-tag 的VpPLD((His)6-VpPLD-WT)對所有磷脂底物均顯示出較高的水解活性。相反的，測得C-末端帶(His)6-tag 的VpPLD（VpPLD-WT-(His)6）對所有磷脂底物的活力最低。統(tǒng)計分析結(jié)果表明：(His)6-VpPLD-WT 的酶活力顯著高于(His)6-VpPLD-WT-(His)6和 VpPLD-WT-(His)6（p＜0.05）。對比(His)6-VpPLD-WT-(His)6和VpPLDWT-(His)6發(fā)現(xiàn)，這兩種酶對DMPC，DSPC 和DOPC的水解活性沒有顯著性差異（p＞0.05）。然而，VpPLDWT-(His)6對DLPC，DPPC 和DAPC 的水解活力顯著低于(His)6-VpPLD-WT-(His)6（p＜0.05）（圖4a）。

2.2.3 (His)6-tag 位置對野生型VpPLD 磷脂頭部選擇性的影響

本研究中，我們選取四種帶有不同極性頭部基團的磷脂底物（DMPC、DMPS、DMPE 和DMPG）繼續(xù)研究三種野生型VpPLD-WT 的底物選擇性差異。如圖4b 所示，(His)6-VpPLD-WT-(His)6和VpPLD-WT-(His)6對DMPS 的水解活力最低(p＜0.05）。(His)6-VpPLD-WT-(His)6對DMPC，DMPG 和DMPE 底物選擇性上沒有顯著差異（p＞0.05）。而VpPLD-WT-(His)6對 DMPC 的水解活性顯著高于其它三種磷脂（p＜0.05），酶活力為7.55 U/g。對于(His)6-VpPLD-WT而言，其對四種磷脂底物選擇性并無顯著性差異（p＞0.05）。

圖4 三種野生型VpPLD 對不同?；滈L度(a)和極性頭部磷脂的選擇性(b)統(tǒng)計分析結(jié)果Fig.4 Comparison on the acyl-chain length selectivity (a) and polar head selectivity (b) between three kinds of wild-type VpPLD constructed in the present study

與三種野生型VpPLD 之間的?；滈L度選擇性趨勢相似，(His)6-VpPLD-WT 對不同頭部基團的磷脂均表現(xiàn)出較高的水解活性（p＜0.05）。(His)6-VpPLDWT-(His)6和VpPLD-WT-(His)6對DMPC，DMPS 和DMPG 的水解活性均沒有顯著差異（p＞0.05）。然而對于底物DMPE 來說，(His)6-VpPLD-WT-(His)6的酶活力為7.51 U/g，要明顯高于VpPLD-WT-(His)6（6.53 U/g）（p＜0.05）（圖4b）。

2.3 N-末端截短對VpPLD 酶學(xué)性質(zhì)的影響

2.3.1 對最適反應(yīng)pH 和溫度的影響

與VpPLD-WT-(His)6相比，VpPLD-Δ1-34-(His)6的最適反應(yīng)pH 從8.0 變?yōu)?.0（圖5a）。同時，VpPLD-Δ1-34-(His)6最 適 溫 度 比 野 生 型 VpPLD(VpPLD-WT-(His)6)最適反應(yīng)溫度提高5 ℃（圖5b）。

圖5 VpPLD-WT-(His)6及其相應(yīng)的N-末端截短突變體VpPLD-Δ1-34-(His)6的最適反應(yīng)pH(a)和溫度(b)曲線Fig.5 Optimum reaction pH (a) and temperature (b) profiles of VpPLD-WT-(His)6 and its corresponding N-terminal truncated mutant VpPLD-Δ1-34-(His)6

2.3.2 對?；滈L度選擇性的影響

與VpPLD-WT-(His)6相比，VpPLD-Δ1-34-(His)6對DLPC 的水解活性明顯降低（p＜0.05）。相反，VpPLD-Δ1-34-(His)6對于其它磷脂的水解活性均未發(fā)生顯著改變（p＞0.05）（圖6a）。

2.3.3 對磷脂極性頭部基團選擇性的影響

與VpPLD-WT-(His)6相比，VpPLD-Δ1-34-(His)6對DMPS 的水解活性顯著提高（p＜0.05），酶活力為7.17 U/g。然而，對于DMPC，DMPE，DMPG 來說，VpPLD-WT-(His)6和VpPLD-Δ1-34-(His)6之間無顯著性差異（p＞0.05）（圖6b）。

圖6 N-末端截短對VpPLD ?；滈L度選擇性(a)和極性頭部選擇性(b)的影響Fig.6 Effect of N-terminal truncation on the acyl-chain length selectivity (a) and polar head selectivity (b) of VpPLD

2.4 C-末端截短對VpPLD 酶學(xué)性質(zhì)的影響

2.4.1 對最適反應(yīng)pH 和溫度的影響

(His)6-VpPLD-WT 和(His)6-VpPLD-Δ469-487 的最適反應(yīng)pH 均為7.0。而(His)6-VpPLD-Δ451-487 的最適反應(yīng)pH 變?yōu)?.0（圖7a）。如圖7b 所示，與(His)6-VpPLD-WT 相似，(His)6-VpPLD-Δ469-487 顯示出較寬的溫度適應(yīng)性（從25 ℃至35 ℃）。然而，(His)6-VpPLD-Δ451-487 在30 ℃下表現(xiàn)出較高的酶活力，隨著溫度升高或降低，酶活力急劇下降。

圖7 (His)6-VpPLD-WT 及其兩個C-末端截短突變體(His)6-VpPLD-Δ469-487 和(His)6-VpPLD-Δ451-487 的最適反應(yīng)pH(a)和溫度(b)曲線Fig.7 Optimum reaction pH (a) and temperature (b) profiles of(His)6-VpPLD-WT and its two C-terminal truncated mutants(His)6-VpPLD-Δ469-487 and (His)6-VpPLD-Δ451-487

2.4.2 對?；滈L度選擇性的影響

圖8 C-末端截短對VpPLD ?；滈L度選擇性(a)和極性頭部選擇性(b)的影響Fig.8 Effect of C-terminal truncation on the acyl-chain length selectivity (a) and polar head selectivity (b) of VpPLD

從圖8a 可以看出，與(His)6-VpPLD-WT 相比，(His)6-VpPLD-Δ469-487 對于除DOPC 外所有的磷脂均表現(xiàn)出較低的水解活性。與(His)6-VpPLD-WT 相比，(His)6-VpPLD-Δ451-487 對DPPC 和DAPC 的水解活性均顯著降低（p＜0.05）；相反，其對DOPC 的活性明顯升高（p＜0.05），酶活力達到10.39 U/g；而對于底物DLPC，DMPC 和DSPC，兩者之間均未發(fā)現(xiàn)顯著性改變（p＞0.05）。對比(His)6-VpPLD-Δ469-487 和(His)6-VpPLD-Δ451-487，發(fā)現(xiàn)(His)6-VpPLD-Δ469-487對DLPC，DMPC，DSPC，DOPC 和DAPC 的水解活力顯著低于(His)6-VpPLD-Δ451-487（p＜0.05）。

2.4.3 對磷脂極性頭部基團選擇性的影響

從圖8b 可以看出，與(His)6-VpPLD-WT 相比，(His)6-VpPLD-Δ469-487 對DMPC，DMPG 和DMPE的水解活性均顯著降低（p＜0.05），而對DMPS 的水解活性無顯著改變（p＞0.05）。與(His)6-VpPLD-WT 相比，(His)6-VpPLD-Δ451-487 對DMPG 和DMPE 的水解活性顯著降低（p＜0.05），而對DMPS 的水解活性顯著提高（p＜0.05）。對比(His)6-VpPLD-Δ469-487 和(His)6- VpPLD-Δ451-487，發(fā)現(xiàn)兩者對DMPG和DMPE的水解活性均無顯著變化。然而，(His)6-VpPLD-Δ451-487 對于DMPC 和DMPS 的水解活性則顯著提高（p＜0.05），酶活力分別為9.40 U/g 和15.65 U/g。

3 討論

3.1 His-tag 位置會對VpPLD 的水解活性和磷脂底物選擇性造成影響

重組蛋白的表達純化是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要環(huán)節(jié)之一。近年來，將多肽或蛋白質(zhì)作為標(biāo)簽，與目標(biāo)蛋白共表達的方法常用來表達純化重組蛋白。傳統(tǒng)的蛋白（多肽）標(biāo)簽有His-tag，Arg-tag，F(xiàn)lag-tag等[9]，近年來又新開發(fā)了一些新型的標(biāo)簽，如Si-tag，Halo-tag，Intein-CBD-tag，ELPs-tag 等[10]。在這些標(biāo)簽中，(His)6-tag 因其體積小、純化成本相對較低、能適應(yīng)較為寬泛的pH（pH 4～10）和特殊環(huán)境（高鹽、強變性劑、非離子型變性劑等）而最受歡迎[11,12]。His-tag 已經(jīng)成功地應(yīng)用于大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞等重組蛋白的表達純化。然而，許多研究發(fā)現(xiàn)，即使His-tag 體積小，但它的存在對酶蛋白的酶學(xué)性質(zhì)仍會造成一定影響[13-16]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)在構(gòu)建的三種VpPLD-WT 中，無論對哪種磷脂底物，(His)6-VpPLD-WT 都表現(xiàn)出較高的水解活性，其次是(His)6-VpPLD-WT-(His)6，而VpPLD-WT-(His)6的活性最低。這些結(jié)果表明，(His)6-tag 的位置對VpPLD-WT的水解活性具有較大的影響。此外，我們還發(fā)現(xiàn)(His)6-tag 對VpPLD-WT 底物選擇性產(chǎn)生影響，特別是當(dāng)將(His)6-tag 連接到蛋白質(zhì) C-末端時，對VpPLD-WT 的底物選擇性影響最大。當(dāng)(His)6-tag 僅位于蛋白C-末端時，推測其可與蛋白自身某些氨基酸產(chǎn)生相互作用力改變活性口袋的空間構(gòu)象，從而導(dǎo)致VpPLD 對不同?；滈L底物水解的選擇性改變，使其更偏向于水解DMPC、DSPC 和DOPC。此外，(His)6-tag的存在，還對VpPLD 的不同極性頭部磷脂底物水解選擇性造成影響。(His)6-tag 位于C-末端時，VpPLD對不同極性頭部磷脂底物不存在選擇性差異。相反的，當(dāng)(His)6-tag 僅位于N-端或N/C-兩端時，則改變了VpPLD 對不同極性頭部磷脂底物的選擇性，使其更偏向于水解DMPC，DMPE 和DMPG。在本研究中，沒有構(gòu)建不帶(His)6-tag 的 VpPLD 來詳細比較VpPLD-WT 與目前三種VpPLD 的影響。但是，當(dāng)前研究結(jié)果已經(jīng)表明不同的(His)6-tag 位置對VpPLD 活性和選擇性所造成的影響。此外，本研究還表明(His)6-tag 位于C-末端能將VpPLD 的最適反應(yīng)pH 從7.0 變到8.0。推測當(dāng)(His)6-tag 連接到VpPLD 的C-末端時，在空間位置上將更靠近酶的催化中心，組氨酸作為一種堿性氨基酸，可能會影響催化口袋的微環(huán)境從而改變酶的最適反應(yīng)pH 值。本研究首次提供了(His)6-tag 對VpPLD 比活力、底物選擇性以及最適反應(yīng)pH 影響的詳細信息。然而，其具體的作用機制仍需作進一步研究。

3.2 N/C-末端截斷對VpPLD 水解活性和選擇性造成較大影響

眾所周知，PLD 作為一種界面反應(yīng)酶。在反應(yīng)過程中PLD 首先需要結(jié)合到磷脂界面上，才能夠接觸反應(yīng)底物并形成共價連接的磷脂酰-酶中間體[17]。在我們之前的研究中，通過構(gòu)建 N-末端截短突變體（VpPLD-Δ1-25-(His)6和VpPLD-Δ1-34-(His)6)和C-末 端 截 短 突 變 體((His)6-VpPLD-Δ469-487 ，(His)6-VpPLD-Δ451-487 和(His)6-VpPLD-Δ434-487）的非活性形式（在催化活性位點單點突變H152A）來嘗試比較不同突變體之間的界面結(jié)合特性[6]。在本研究中，為進一步了解N/C-末端片段缺失對VpPLD 的比活力和底物選擇性的影響，我們設(shè)計并構(gòu)建了相應(yīng)的截短突變體。遺憾的是，在構(gòu)建突變體時，其中兩個 突 變 體（VpPLD-Δ1-25-(His)6和(His)6–VpPLD-Δ434-487）無法獲得陽性克隆，均未構(gòu)建成功。確切原因尚不清楚。因此，本研究只將構(gòu)建成功的突變體與VpPLD-WT 進行比較。從圖6a 可以看出，除VpPLD-Δ1-34-(His)6對DLPC 顯示較低的水解活性外（p＜0.05），VpPLD-WT-(His)6和VpPLD-Δ1-34-(His)6對不同?；滈L度磷脂的水解活性均無顯著變化（p＞0.05）。該結(jié)果表明，刪除前34 個氨基酸并不會改變VpPLD 對長鏈磷脂（C14-20）的選擇性。與VpPLD-WT-(His)6相比，VpPLD N-末端前34 個氨基酸的缺失會明顯增強VpPLD 對DMPS 的水解活性，使其酶活力從5.11 U/g 增加為7.17 U/g，而對于其它磷脂的水解活性，未發(fā)生顯著改變（圖6B）。然而，我們之前的結(jié)果表明， VpPLD-WT-(His)6和VpPLD-(His)6-Δ1-34 對磷脂單分子層的最大插入壓力（MIP）或協(xié)同因子α 差異不顯著（p＞0.05）[6]。MIP和協(xié)同因子α 是兩個用于評估蛋白質(zhì)與單分子膜的界面結(jié)合特性的主要參數(shù)。以上結(jié)果表明，VpPLDΔ1-34-(His)6對DMPS 水解活性的改變并非是由于界面吸附特性改變所造成。同時，我們也發(fā)現(xiàn)對于底物DMPE 來說，界面吸附和水解活性之間呈現(xiàn)出相反的結(jié)果：與VpPLD-(His)6-WT（29.8±2.8 mN/m）相比，VpPLD-(His)6-Δ1-34 的MIP 值更高，為47.8±8.7 mN/m[6]。然而，在本研究中未發(fā)現(xiàn)截短后對DMPE的水解活性造成顯著變化。對于DMPC 和DMPG 而言，VpPLD-WT-(His)6和VpPLD-Δ1-34-(His)6的水解活性沒有顯著改變（圖6b）。該結(jié)果與我們之前關(guān)于界面吸附的趨勢保持一致[6]。綜合以上所有結(jié)果可以看出，PLD 催化磷脂水解反應(yīng)是一個非常復(fù)雜的過程。雖然可將其細分為界面吸附和界面催化兩個過程來分析，但實際反應(yīng)過程可能不像我們認為的那么簡單。

與(His)6-VpPLD-WT 相比，(His)6-VpPLD-Δ469-487 對所有磷脂底物均表現(xiàn)出相對較低的水解活性（圖8）。此外，本研究發(fā)現(xiàn)除DAPC，DMPS，DMPG和DMPE 外，(His)6-VpPLD-Δ451-487 對于大多數(shù)磷脂的水解活性沒有顯著變化。值得一提的是，與(His)6-VpPLD-WT 和(His)6-VpPLD-Δ469-487 相比，(His)6-VpPLD-Δ451-487 的水解活性顯著增強。以上結(jié)果表明，VpPLD 中451～487 肽段的氨基酸對VpPLD的水解活性發(fā)揮重要影響作用。此外，從底物選擇性角度分析發(fā)現(xiàn)：(His)6-VpPLD-WT 和(His)6-VpPLDΔ469-487 對不同酰基鏈長度和極性頭部磷脂的選擇性并沒有顯著改變。但是，(His)6-VpPLD-Δ451-487 對DPPC，DMPG 和DMPE 的選擇性明顯降低。該結(jié)果表明，451～469 肽段對VpPLD 的底物選擇性具有重要影響。后續(xù)可針對這些肽段的氨基酸進行單點突變，以進一步鑒定與VpPLD 底物選擇性密切相關(guān)的氨基酸殘基位點信息并揭示其具體調(diào)控機制。

4 結(jié)論

(His)6-tag 的位置不僅影響到重組VpPLD 蛋白的界面吸附特性，而且會不同程度改變VpPLD 重組蛋白的催化活性和選擇性等酶學(xué)性質(zhì)。尤其是當(dāng)(His)6-tag 位于蛋白的C-末端時，影響效果最為顯著，導(dǎo)致酶蛋白活性顯著降低，最適反應(yīng)pH 從7.0 變到8.0，同時，底物選擇性也發(fā)生相應(yīng)改變；N-末端前34 個氨基酸的缺失將導(dǎo)致VpPLD 對DMPS 的選擇性顯著增強；C-末端截短突變的分析結(jié)果表明：C-末端451～469 肽段對VpPLD 的底物選擇性具有重要影響。本研究結(jié)果將為下一步針對該酶的分子改造以進一步提高酶蛋白活力以及針對特定磷脂底物的選擇性改造提供重要靶點信息。