陸敏濤，羅婧，任廷遠

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的一種以高血糖為特征的代謝性疾病，主要由胰島素作用抵抗和胰島素分泌缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂[1,2]。除少數(shù)妊娠糖尿病和特殊類型糖尿病外，糖尿病主要分為兩型：1-型糖尿病和2-型糖尿病，1-型是胰島素分泌絕對不足引起的；2-型是胰島素分泌相對不足或受體受阻引起的[3,4]。隨著社會環(huán)境的發(fā)展，糖尿病的發(fā)病幾率越來越高，在中國20 歲以上的成人糖尿病患病率已為9.7%，目前已達9240 萬，還有1.48 億糖尿病前期病人，其中90%～95%是2-型糖尿病[5-7]。由此可見，糖尿病的防治迫在眉睫，如何預防和治療這類慢性疾病成為了目前的研究熱點。

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim）是蕓香科（Rutaceae）花椒屬（ZanthxylumL.）植物的果實，作為傳統(tǒng)調(diào)味料和中藥，被譽為“八大調(diào)味品”之一[8]。我國是花椒第一大生產(chǎn)國，2018 年年產(chǎn)量約45 萬t[9]?；ń返乃幱脙r值早已得到認可，現(xiàn)代醫(yī)學研究認為花椒具有抗氧化、殺蟲、麻醉、抗炎鎮(zhèn)痛、降血脂、除皺、抗癌、祛風除濕等多種作用[10,11]?；ń仿樗厥怯苫ń诽崛〉囊幌盗絮０奉惢衔?，也稱其為花椒酰胺[12,13]，是產(chǎn)生麻味風味的主要來源[14,15]，迄今為止，已從花椒果皮中分離并鑒定出超過25 種花椒麻素[16,17]。隨著分離技術及檢測技術的不斷發(fā)展，花椒麻素的種類還在不斷的增加。研究表明，花椒麻素在-20 ℃石油醚中可以結(jié)晶并析出，呈現(xiàn)白色晶體，易溶于熱石油醚、微溶于水?；ń仿樗卦诔叵聵O不穩(wěn)定，短暫暴露在空氣中即可發(fā)生氧化或聚合反應而形成深色的黏稠膏狀物質(zhì)[18]。You YM[19]等研究表明，花椒麻素具有降糖作用可能是通過上調(diào)肝臟中PEPCK、GK 和G6Pase 的表達量以及修復受損的胰腺β細胞從而上調(diào)胰腺中PDX-1、GK 和GLUT2 的mRNA 水平和蛋白表達量而引起的。Ren TY[20,21]等研究表明，花椒麻素對糖尿病大鼠的降糖機制是激活AMPK 信號通路，介導GLUT4 從細胞質(zhì)快速轉(zhuǎn)運到細胞膜，達到降糖效果，且發(fā)現(xiàn)花椒麻素能改善大鼠的蛋白質(zhì)代謝紊亂。陳朝軍[22]等研究表明，花椒素和辣椒素能使大鼠體重增加速率減慢，減輕大鼠的脂肪肝癥狀，對膽固醇代謝紊亂有一定的改善作用。游玉明[23]等人研究發(fā)現(xiàn)花椒麻素有改善糖尿病導致的腸道菌群紊亂的作用，灌胃花椒麻素后，盲腸內(nèi)容物中某些益生菌數(shù)量顯著增加，而某些條件致病菌數(shù)量顯著降低。這些結(jié)果均暗示了花椒麻素極有可能在因糖脂代謝紊亂導致的高脂血癥及糖尿病等預防和治療方面具有顯著的功效。

花椒麻素在改善糖尿病方面，以往的研究主要集中在花椒麻素改善1-型糖尿病、肥胖等模型糖脂代謝的效果及機制，而對2-型糖尿病機體糖脂代謝紊亂方面的研究較少。T2DM 是由多種因素導致的代謝性疾病[24]，隨病情的發(fā)展患者會出現(xiàn)肝腎損傷、壞疽、視網(wǎng)膜脫落等一系列的并發(fā)癥[25,26]。目前臨床上治療糖尿病的方法主要為口服化學藥物（如雙胍類）或者注射胰島素的方法來控制血糖，長期使用藥物會對身體的正常生理功能產(chǎn)生嚴重的不良影響[27]，中藥治療相比于化學藥治療有更好的治療優(yōu)勢，可以減輕患者毒副反應，增強患者機體免疫功能[28]。由于STZ 能夠選擇性地破壞β細胞上轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄，激活免疫應答和巨噬細胞抗原的改變，進而導致β細胞結(jié)構的破壞及細胞的損傷[29,30]，因此，本研究探索花椒麻素對調(diào)節(jié)STZ和高脂高糖聯(lián)合誘導的2-型糖尿病小鼠體內(nèi)糖脂代謝紊亂的作用效果，旨在探索花椒麻素預防和治療2-型糖尿病的效果及作用機制，為花椒麻素的開發(fā)與利用提供科技理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒麻素，實驗室自制（＞98%），提取過程參考任文瑾[31]的方法并略作修改；昆明種雄性小鼠，SPF級，20 g，55 只，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。鏈脲佐菌素（STZ），美國sigma 公司；鹽酸二甲雙胍，美國sigma 公司；總蛋白定量測試盒（BCA 法）、甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白測定試劑盒、低密度脂蛋白測定試劑盒、丙二醛測定試劑盒，由南京建成生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

分析天平Y(jié)H-A5003，五星衡器有限公司；恒溫鼓風干燥箱DHG-9070，上海齊欣科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋HH-4，常州奧華儀器有限公司；超聲波清洗器KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司；血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；可調(diào)高速勻漿器FSH-2，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；紫外分光光度計L5S，上海儀電分析儀器有限公司；連續(xù)波長多功能酶標儀SpectraMax190，美國Molecular Devices公司；高速冷凍離心機H1-16KR，湖南可成儀器設備有限公司；光學顯微鏡Eclipse Ci-L，日本Nikon 公司。

1.3 動物飼養(yǎng)與樣品采集

實驗經(jīng)貴州大學動物實驗倫理委員會批準（編號：EAE-GZU-2020-P003），符合動物實驗倫理。將55只體質(zhì)量為22～24 g 的4～6 周齡健康雄性昆明小鼠飼養(yǎng)在通風良好，室溫23±2 ℃，相對濕度45%～65%，12 h/12 h 明暗交換的環(huán)境中，自由攝食和飲水?；A飼料適應性飼喂一周后，根據(jù)小鼠體質(zhì)量隨機分為空白組（n=10）和高脂高糖組（n=45），空白組喂普通飼料，高脂高糖組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)6 周后，小鼠經(jīng)過12 h 禁食，不禁水，注射60 mg/(kg·bw) STZ造模，造模期間自由攝食、飲水。建模后第7 d，禁食12 h，然后尾尖采集血樣，血糖儀測量空腹血糖值（FBG），當FBG 值高于11.10 mmol/L 時，則造模成功[32,33]，并篩除建模失敗的小鼠。把建模成功的40只小鼠分為4 組（n=10），分為空白組、模型組、花椒麻素低劑量組0.4 mg/(kg·bw)、花椒麻素高劑量組0.8 mg/(kg·bw)以及陽性對照組。

將實驗室所制花椒麻素按照1 mL/100 g 小鼠體重灌胃量，精密稱取花椒麻素溶于食用大豆油中，分別配制成濃度為4 mg/mL和8 mg/mL的花椒麻味物質(zhì)溶液。于每日上午9:00～11:00 分別給低劑量組、高劑量組灌胃4 mg/mL 和8 mg/mL 的花椒麻素，空白組和模型組分別灌胃等量的大豆油，陽性組灌胃生理鹽水配制的鹽酸二甲基雙胍溶液100 mg/(kg·bw)。對照組給予基礎飼料，其余各組給予高脂高糖飼料。小鼠高脂高糖飼料配方參考《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》配制。實驗期間，小鼠自由飲水和攝食，每周稱體質(zhì)量并記錄采食量與飲水量，實驗周期為28 d。

各組小鼠連續(xù)灌胃28 d 后禁食不禁水12 h，摘眼球取血，裝于離心管中，在0.5 h 內(nèi)迅速進行離心處理（4000 r，4 ℃，15 min），將上層血清放入-80 ℃冰箱中冷藏留待后期檢測。小鼠脫頸處死后，在冰上迅速被解剖取出肝臟，用生理鹽水沖洗去污血后將其分為六份并分別記錄重量，裝入小袋并用錫紙包裹，放入臨時液氮箱中，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中留待后續(xù)指標檢測[34]。

1.4 指標測定

1.4.1 血糖值的測定

在灌胃試劑后的第0、7、14、21 和28 d，禁食不禁水6 h，使用血糖儀剪尾采血測定空腹血糖值[35]。

1.4.2 口服糖耐量測定

連續(xù)灌胃28 d，禁食不禁水12 h，根據(jù)2.00 g/(kg·bw)灌胃葡萄糖溶液，通過剪尾取血測量0、0.5、1 和2 h 時的血糖水平[36]，觀察各組小鼠血糖的變化情況。血糖曲線下面積（AUC）根據(jù)以下公式計算[37]：

式中：A、B、C 和D 是灌胃葡萄糖溶液后0、0.5、1 和2 h 的血糖值。

1.4.3 理化指標的測定

血清和肝臟中的甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及丙二醛（MDA）的含量測定，具體步驟見試劑盒說明書進行。

1.5 肝臟組織切片分析

解剖摘取各組小鼠肝臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，進行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片制作切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylineosinstaining，HE）染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織結(jié)構并分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

本研究全部的統(tǒng)計學分析均由SPSS 22.0 完成，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間分析比較用單因素方差分析，并用LSD、Duncan 法進行組間兩兩比較，以p＜0.05 表示差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒麻素對糖尿病小鼠體重、進食量及飲水量的影響

“三多一少”是糖尿病的典型癥狀，即多飲、多食、多尿和體重減輕[38]。與空白組相比，小鼠給予STZ 注射后，其食量和飲水量都明顯增加，出現(xiàn)多飲、多食、多尿等典型的糖尿病癥狀，同時活動量減少，且體毛蓬松無光澤、精神萎靡。由表1 看出，在試驗期間，空白組小鼠體重增加了19.65%，而模型組體重減少了6.30%，與空白組存在顯著（p＜0.05）差異，說明建模的成功。兩個劑量組有效的抑制了糖尿病小鼠的體重減少，其中高劑量組作用顯著（p＜0.05）。由此可見，體重的增量和灌胃劑量呈現(xiàn)一定的劑量關系。由圖1知，進食量與飲水量的糖尿病模型組與空白組比較，都存在顯著性差異，驗證了糖尿病的癥狀；在經(jīng)過花椒麻素灌胃治療28 d 后，高、低劑量組的進食量都比模型組降低且顯著（p＜0.05）差異；高劑量組的飲水量與模型組差異顯著（p＜0.05），低劑量的飲水量比模型組低但差異不顯著（p＞0.05）?；ń仿樗啬芨纳铺悄虿⌒∈蟮陌Y狀，其中，高劑量組的作用接近于陽性對照組。這與陳小敏[39]等人研究發(fā)現(xiàn)刺梨汁可改善糖尿 病小鼠的“三多一少”現(xiàn)象，與本實驗結(jié)果相一致。

表1 花椒麻素對各組小鼠體重、進食量及飲水量的影響Table 1 Effect of Zanthoxylum on body weight, food intake and water consumption of mice in each group (n=10)

圖1 各組小鼠進食量與飲水量的變化Fig.1 Changes of food intake and water consumption of mice in each group (n=10)

2.2 花椒麻素對2-型糖尿病小鼠空腹血糖的影響

空腹血糖是糖尿病的基礎數(shù)據(jù)，表示糖尿病患者的即時血糖水平，反映了基礎胰島功能，是判斷糖尿病的主要依據(jù)[40]，根據(jù)國際通用的糖尿病診斷標準，正常人空腹血糖在3.3～6.1 mmo1/L 之內(nèi)，高于11.1 mmol/L 則被診斷為糖尿病[41]，王祖哲[42]等人研究發(fā)現(xiàn)刺參低聚肽可降低糖尿病小鼠的高血糖。由圖2 可知，給藥處理前（0 d），糖尿病小鼠空腹血糖值均大于11.1 mmol/L，且顯著（p＜0.05）高于正常對照組，提示糖尿病模型造模成功，各組糖尿病小鼠間給藥前空腹血糖值無顯著差異。然而，隨著花椒麻味物質(zhì)灌胃時間的延長，各組小鼠空腹血糖值發(fā)生了變化；空白組一直保持在正常范圍內(nèi)，而模型組血糖越來越上升，證明病情越來越嚴重，經(jīng)灌胃治療28 d 后，高、低劑量組小鼠空腹血糖分別降低了6.23%和3.32%，呈現(xiàn)出一定的劑量效應。

圖2 各組小鼠空腹血糖的變化Fig.2 Changes of fasting blood glucose in mice of each group(n=10)

2.3 花椒麻素對糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

糖耐量是指機體對葡萄糖的耐受能力[43]，在正常機體中，當葡萄糖含量突然增加時，機體會迅速反應，分泌出更多的胰島素；從而使體內(nèi)葡萄糖水平始終維持在正常范圍內(nèi)。因此，葡萄糖耐量實驗可以很好地反映出機體對體內(nèi)糖含量的調(diào)控能力和體內(nèi)胰島β細胞的功能狀況[44,45]。由圖3a 可以看出，正?？瞻讓φ战M小鼠在灌胃葡萄糖后體內(nèi)血糖水平很快就上升到最高水平，隨后也迅速降低，2 h 后即可回到正常水平。而模型組小鼠在灌胃葡萄糖后體內(nèi)血糖水平很快就上升到最高水平后居高不下。與模型組相比，陽性對照組小鼠在灌胃葡萄糖后血糖水平在0.5 h 時即達到最高水平，隨后快速下降，雖然在2 h 后未能回到初始狀態(tài)，但仍可體現(xiàn)出陽性對照組小鼠的病情已有明顯好轉(zhuǎn)。高、低劑量組在0.5 h 時也到達最高水平，隨后快速下降，雖不能回到初始水平，但能證明花椒麻素可以改善小鼠的糖耐量，且高劑量比低劑量效果更好。分析圖3b，模型組的糖耐量曲線下面積比空白組顯著（p＜0.05）增高，高劑量、陽性對照組與模型組存在顯著（p＜0.05）差異，低劑量組有降低趨勢但未達到顯著。

圖3 各組小鼠糖耐量及曲線下面積的變化Fig.3 Changes of glucose tolerance and area under curve in mice of each group (n=10)

2.4 花椒麻素對糖尿病小鼠血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 的影響

T2DM 是一種由于體內(nèi)胰島素分泌不足或出現(xiàn)胰島素抵抗而引發(fā)的慢性代謝性疾病。T2DM 患者普遍伴隨著不同程度的脂代謝紊亂，高血脂又會引起胰島素抵抗[46]。脂質(zhì)代謝異常是糖尿病的常見的并發(fā)癥之一。與正常對照組小鼠相比，糖尿病模型對照組小鼠血清中甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著上升，而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著（p＜0.05）下降，說明糖尿病病變導致了小鼠血脂代謝的紊亂。當采用不同劑量的花椒麻素灌胃28 d 后，由圖表2 可分析出，與模型組小鼠相比，高、低劑量組小鼠的血清TG 水平分別下降了13.64%、10.71%；高、低劑量組小鼠的血清TC 水平分別下降了21.98%、17.83%。HDL-C 水平顯著（p＜0.05）上升；LDL-C 水平有降低趨勢，但未達到顯著（p＞0.05）水平，說明花椒麻素可以在一定程度上改善因2-型糖尿病引起的血清TG、TC 和HDL-C、LDL-C 代謝紊亂，且有劑量效應。

本研究結(jié)果顯示，模型組的TG、TC、HDL-C、LDL-C 均與模型組存在顯著差異，證明T2DM 小鼠存在脂代謝紊亂，花椒麻素干預后能夠顯著降低T2DM小鼠TC、TG 水平，升高HDL-C 水平；LDL-C 雖未達到顯著水平，但存在降低的趨勢，這與陳萍[47]等人研究結(jié)果相一致，進一步證明了花椒麻素對T2DM 小鼠糖脂代謝的回調(diào)作用。

表2 各組小鼠血清相關指標的變化Table 2 Changes of serum related indexes of mice in each group (n=10)

2.5 花椒麻素對糖尿病小鼠肝臟TG、TC 的影響

花椒麻素對2-型糖尿病小鼠肝臟TG、TC 的影響如圖4 所示，模型組小鼠TG、TC 含量比空白組分別顯著（p＜0.05）增加了79.56%、310.44%。與模型組相比，經(jīng)過28 d 的灌胃后，高、低劑量組的肝臟TG值均比模型組降低了28.31%；高、低劑量組的肝臟TC 值分別比模型組降低了43.53%和28.94%。

2.6 花椒麻素對糖尿病小鼠血清和肝臟中MDA 的影響

氧化應激是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的因素之一[48]，氧化應激是指活性分子和活性氧簇等的過度生成和（或）清除減少，從而造成體內(nèi)自由基的生成和抗氧化防御系統(tǒng)之間的嚴重失衡[49]。MDA 水平可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，是氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物，從而反映出細胞損傷的程度[50]。MDA 含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，測試MDA 的量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接的反應出細胞損傷的程度。由圖5 可知，與空白組相比，模型組的血清、肝臟MDA含量分別升高了356.67%、251.24%。在經(jīng)過28 d 的花椒麻素灌胃后，與模型組相比，高、低劑量的血清MDA 分別顯著（p＜0.05）降低了39.43%和39.56%，高、低劑量組的肝臟MDA 值分別比模型組降低了52.12%和47.45%，與藥物治療的陽性對照組已無顯著差異（p＞0.05）。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)花椒麻素灌胃28 d 后，能夠顯著降低T2DM 小鼠體內(nèi)的MDA水平，這與高雪婧[51]等人實驗結(jié)果相一致，表明花椒麻素能夠有效降低T2DM 小鼠的氧化應激水平，增強其抗氧化能力。

圖4 各組小鼠肝臟相關指標的變化Fig.4 Changes of liver related indexes of mice in each group(n=10)

圖5 各組小鼠MDA 含量的變化Fig.5 Changes of MDA content in mice of each group

2.7 肝臟病理學分析

如圖6 所示，空白組小鼠肝細胞結(jié)構清晰，細胞核形態(tài)正常。模型組小鼠肝細胞排列松散，大量脂肪空泡變性，胞體腫脹，胞質(zhì)疏松淡染。與模型組相比，二甲雙胍組的肝細胞排列整齊，無明顯脂肪空泡，形態(tài)得到改善；經(jīng)過28 d 的花椒麻素治療，高、低劑量組的肝細胞比模型組排列較整齊，有少量空泡變性，形態(tài)有所改善。

圖6 肝臟病理學分析Fig.6 Liver patholog

3 結(jié)論

本實驗采用高脂高糖飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導的2-糖尿病小鼠為模型，研究花椒麻素對糖尿病小鼠的影響。結(jié)果顯示花椒麻素能緩解糖尿病小鼠的“三多一少”癥狀，高、低劑量組的空腹血糖值分別比模型組降低了6.23%和3.32%，并提高了糖耐量，降低糖尿病小鼠體內(nèi)的TG、TC、LDL-C 及MDA 含量，升高HDL-C 含量，使糖尿病小鼠的血脂和肝脂得到有效改善，且HE 染色結(jié)果顯示花椒麻素能降低肝組織的病理損傷。表明了花椒麻素能夠從糖代謝、脂代謝及氧化應激方面對2-型糖尿病具有治療效果，并呈現(xiàn)出了一定的劑量關系。為日后更深入的研究和利用花椒麻素預防和治療2-型糖尿病提供了一定的理論依據(jù)。但其具體的作用機制，仍待進一步研究。