余明芳 吳曉

1.西南醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合學院·附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 640000 2.瀘州市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，四川 瀘州 646000

骨代謝是指在骨骼重建過程中發(fā)生的分解合成代謝，是破骨細胞吸收舊骨和成骨細胞形成新骨并進一步礦化的動態(tài)平衡過程。骨轉(zhuǎn)換標志物(bone turnover markers，BTM)是骨重塑的不同階段由成骨細胞和破骨細胞產(chǎn)生、釋放的蛋白質(zhì)或基質(zhì)降解產(chǎn)物，BTM包括骨形成和骨吸收，可動態(tài)反映骨代謝情況，在骨代謝疾病的診斷及鑒別診斷、治療效果評估及預測骨折風險方面有重要意義。

晝夜節(jié)律(circadian rhythm)又稱近日節(jié)律，是指生命活動以近似24 h為一個規(guī)律性循環(huán)周期的變動。晝夜節(jié)律可維持機體的多種生理功能，調(diào)節(jié)機體應對外界環(huán)境變化。研究證實晝夜節(jié)律在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，大部分骨轉(zhuǎn)換標志物都存在晝夜節(jié)律性。晝夜節(jié)律生物鐘調(diào)節(jié)骨代謝的生理、病理反應，使大部分骨代謝標志物在體液呈現(xiàn)晝夜振蕩。生物鐘基因是晝夜節(jié)律的重要元件，鐘基因之間形成的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)在細胞核內(nèi)驅(qū)動節(jié)律性的晝夜轉(zhuǎn)錄，對骨代謝中起關(guān)鍵作用的基因和蛋白的表達和活化進行調(diào)控。晝夜節(jié)律紊亂可破壞骨吸收和骨形成之間的平衡，導致骨骼的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，從而損害骨骼健康，導致骨硬化癥、骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生并增加骨折風險。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與白班相比夜班人員發(fā)生骨折(股骨、手腕或脊柱)的比例增加了近2倍[1]。一項干預性研究將10名健康男性模擬輪班工作，發(fā)現(xiàn)其骨形成標志物I型膠原氨基端前肽(procollagen I N-terminal procollagen，P1NP)水平顯著降低[2]。由此可見，生物鐘與骨代謝關(guān)系密切，二者相互交互，相輔相成。

1 骨形成標志物具有晝夜節(jié)律性

骨形成相關(guān)蛋白主要包括骨鈣素(osteocalcin，OC)、骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、骨膜蛋白(periostin，POSTN)和骨唾液蛋白 (bonesialoprotein，BSP)等。前期研究發(fā)現(xiàn)骨形成相關(guān)蛋白在機體的表達水平出現(xiàn)日夜波動，且具有一定的節(jié)律性。OC是成骨細胞和肥大軟骨細胞合成的主要非膠原性羥基磷灰石結(jié)合蛋白，它可促進皮質(zhì)骨的礦化，用來反映成骨細胞的活動[3-4]，研究發(fā)現(xiàn)其在多種生物體內(nèi)均呈現(xiàn)晝夜振蕩。人體血尿標本中OC均呈現(xiàn)顯著的晝夜節(jié)律性，血清OC濃度在午夜達到峰值[5-6]，尿OC水平則上午高，下午低[7]。而在單峰駱駝體內(nèi)，其峰值和谷值則出現(xiàn)在13:00和18:00[8]。然而，豬的血清OC最高和最低水平卻分別出現(xiàn)在18:00和06:00，實驗同時發(fā)現(xiàn)OC水平在幼年期較高，并且與年齡呈負相關(guān)[9]。另外，成骨細胞合成和分泌的OPG是重要的骨形成蛋白之一，它與核因子受體活化因子-κB配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)結(jié)合，阻止RANKL與細胞核因子-κB 受體活化因子(RANK)相互作用，從而防止骨骼過度吸收以達到促進骨形成的目的。研究顯示機體OPG表達在明相初期較低[10]，并遵循晝夜節(jié)律模式呈現(xiàn)日夜變化。另一項分析也表明人體OPG呈現(xiàn)出白天增加，夜間減少的晝夜變化[11]。此外，可誘導成骨細胞分化的BMP在骨形成過程中也發(fā)揮著重要作用，也有動物研究發(fā)現(xiàn)BMP4 mRNA在骨組織中的表達在ZT8時達到頂峰，振蕩周期為24.8 h，呈近日節(jié)律[12]。

骨形成相關(guān)酶主要包括骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)、組蛋白去甲基化酶(KDM4A)和堿性磷酸酶(ALP)。BALP是屬于骨細胞的胞外酶，由成骨細胞合成和分泌，能水解多種磷酸酯，為羥磷灰石的沉積提供必需的磷酸，促進骨形成。動物實驗研究顯示BALP的峰值出現(xiàn)在下午15:04[13]。此外，骨形成相關(guān)肽是骨組織主要蛋白質(zhì)I型膠原的合成過程中產(chǎn)生的，占骨基質(zhì)的90%，人體PINP的血液濃度與骨形成的組織形態(tài)計量呈正相關(guān)[14]，具有明顯的晝夜節(jié)律性，其濃度呈單峰模式，日間濃度較低，峰值在凌晨3點[5,15]。

由此可見，大部分骨形成標志物如OC、OPG、BMP、BALP和PINP，均具有明顯的晝夜節(jié)律性，進一步分析顯示其峰值濃度大多出現(xiàn)在夜間。

2 骨吸收標志物的日夜振蕩變化

骨吸收相關(guān)蛋白主要包括成纖維細胞生長因子-23(fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF-23)、RANKL和骨硬化素(sclerotin，SOST)。其中，F(xiàn)GF-23由骨細胞分泌，是調(diào)節(jié)磷酸鹽和維生素D代謝的重要細胞因子，在骨礦化中起著重要作用，與骨小梁微結(jié)構(gòu)受損正相關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)人體FGF-23水平表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，在早晨達到峰值[17-19]，進一步研究將其峰值時間定位在02:30至11:30[17]。此外，RANKL也是重要的骨吸收蛋白之一，它刺激破骨細胞分化、成熟和活性，從而增加骨吸收。前期動物研究顯示RANKL在光照開始時呈現(xiàn)高表達[10]，并遵循晝夜節(jié)律模式表達。另外，骨細胞衍生蛋白SOST通過抑制Wnt信號通路減少骨形成，并通過產(chǎn)生RANKL刺激破骨細胞骨吸收來調(diào)節(jié)骨重建。有研究發(fā)現(xiàn)人體SOST具有一定的時間效應，表達出現(xiàn)晝夜波動，其峰值在13:00，谷值在9:00[20]。

骨吸收相關(guān)酶如抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatasey，TRACP)主要存在于破骨細胞內(nèi)，通過結(jié)合蛋白酶參與骨代謝過程，是骨吸收和破骨細胞活性的良好標志物。研究表明大鼠TRAP具有特征性的晝夜節(jié)律，在明相達到高峰(13:00)，其峰值范圍波動在09:00至13:00，谷值范圍則出現(xiàn)在21:00至01:00[21]。同樣的，牛血液樣本TRACP經(jīng)Cosinor分析也顯示有明顯的節(jié)律，其峰值出現(xiàn)在中午12點[22]。另外，由破骨細胞表達的組織蛋白酶K(CTSK)主要參與編碼與骨吸收相關(guān)的蛋白酶，它在明相開始時表達最高，提示光照初期骨吸收增加[10]。

此外，骨吸收相關(guān)肽如I型膠原C端肽(C-terminal cross-linked telopeptide of type I collagen，CTX-I)也具有晝夜節(jié)律變化，研究顯示CTX-I是I型膠原分解代謝的產(chǎn)物，其血藥濃度與骨吸收的組織形態(tài)計量正相關(guān)[14]。多項研究證實CTX-I在人體存在晝夜節(jié)律性，峰值出現(xiàn)在凌晨5點半左右，谷值在14時左右[17,23-25]。進一步研究證實唾液CTX-I與血清和尿液一樣也具有節(jié)律振蕩[23]，表明CTX-I在機體各個水平均存在日夜變化，受外圍生物鐘影響。而終末骨基質(zhì)代謝而來、代表體內(nèi)同期骨基質(zhì)的病理性破壞水平的I型膠原交聯(lián)羧基末端肽(cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen，ICTP)在動物體內(nèi)的晝夜節(jié)律變化有統(tǒng)計學意義，峰值在凌晨03:02[13,26]，而大鼠ICTP則呈現(xiàn)出清晨最高，深夜最低的晝夜節(jié)律特點[27]。

此外，骨吸收相關(guān)氨基酸也大多具有晝夜節(jié)律性。骨基質(zhì)Ⅰ型膠原纖維的降解產(chǎn)物DPD影響著破骨細胞活動，不同機體內(nèi)的DPD均存在晝夜節(jié)律變化，人體呈現(xiàn)出下午平均血清DPD濃度比上午低，動物在18時最低[28-30]。個體DPD活性達到峰值的時間目前存在爭議[31]，研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)DPD mRNA的表達峰相在凌晨5點[32]。其外周血單核細胞(PBMCs)DPD活性則在00:30至02:00達到高峰[33]。而小鼠肝臟DPD表達的平均值則在03:00最低，15:00最高[34]。大鼠PYD也具有晝夜節(jié)律性，其峰值出現(xiàn)在下午1點左右[21]。除了血清和尿液，研究發(fā)現(xiàn)人口腔黏膜DPD也具有節(jié)律性，午夜升高，峰值約在01:00左右[35]。還有研究發(fā)現(xiàn)骨吸收相關(guān)基因如c-Fos也存在節(jié)律變化，在動物骨骼中有節(jié)律性的表達，在黑暗期中期，也就是小鼠的活躍期表達最高[36]。

綜上所述，大多數(shù)骨破壞標志物如FGF-23、RANKL、SOST、TRACP、CTX-I、ICTP、DPD等均具有晝夜節(jié)律性，其峰值時相大多出現(xiàn)在夜間，與骨形成標志物類似，且較骨形成標志物的晝夜節(jié)律更加穩(wěn)定，大都具有明確的峰值和谷值時間。

3 晝夜節(jié)律與骨代謝雙向交互

3.1 紊亂的晝夜節(jié)律變化打破了骨代謝的動態(tài)平衡

晝夜節(jié)律紊亂會抑制骨形成，加速骨吸收，破壞骨代謝的動態(tài)平衡。病理狀態(tài)下，晝夜節(jié)律紊亂可引起多種骨形成標志物表達下調(diào)，抑制成骨細胞活性，減少骨形成。有研究評價了晝夜節(jié)律改變的小鼠的骨代謝水平，發(fā)現(xiàn)其P1NP的血漿水平降低，表明成骨細胞產(chǎn)生的骨基質(zhì)減少[10]。這與迄今為止在人類中進行的唯一一項干預性研究是一致的，該研究顯示，由于睡眠限制和晝夜節(jié)律紊亂，P1NP下調(diào)[2]。另外，BMP2有顯著促成骨作用，實驗證實Bmal1顯著增加了BMP2的表達，從而增加成骨分化；在MC3T3-E1細胞中敲除Bmal1基因后BMP2表達下調(diào)[37]。晝夜節(jié)律紊亂會誘導鐘基因表達異常，并進一步促使多種細胞因子異常激活破骨細胞的分化并增強其功能，加速骨吸收。一項研究[38]在72 d內(nèi)反復限制大鼠睡眠，發(fā)現(xiàn)其破骨細胞活性標志物TRACP顯著增加。骨吸收加速時鐘基因(Rev-erbα、Bmal1、per1、per2、Cry1、Clock)以及參與破骨細胞增殖和功能的基因(RANKL、OPG、CTSK)和骨細胞功能(c-Fos)在骨中的表達模式。每周交替的明暗循環(huán)擾亂了骨中節(jié)律性時鐘基因的表達，并導致P1NP和TRAP水平下降，提示骨轉(zhuǎn)換減少。這些效應與15周的明暗循環(huán)后骨小梁結(jié)構(gòu)改變和皮質(zhì)礦化增加相一致，這可能會長期內(nèi)對骨強度產(chǎn)生負面影響。總而言之，這些結(jié)果表明生理正常的晝夜節(jié)律對維持骨骼健康非常重要，并強調(diào)了進一步研究輪班工作和骨骼疾病之間的聯(lián)系的重要性[10]。成骨細胞敲除Bmal1后，RANKL的表達明顯上調(diào)，而Bmal1/Clock過表達則相反地抑制了成骨細胞中RANKL的表達，這些結(jié)果提示，成骨細胞時鐘系統(tǒng)通過調(diào)控成骨細胞RANKL表達，在一定程度上調(diào)控骨吸收和骨量[39]。活化T細胞核因子(NFAT)作為OPG-RANK-RANKL系統(tǒng)下游的信號分子，對破骨細胞的分化發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，分化后的破骨細胞可實現(xiàn)骨吸收從而導致骨密度降低。CTSK是破骨細胞活性增強的標志。研究表明敲除Bmal1會下調(diào)NFATC2的水平的表達[40]，而Bmal1的表達上調(diào)則會增強CTSK和NFATc1的表達[41]。另外，輪班工人血清FGF-23水平顯著高于傳統(tǒng)日班工人[42]。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞中PER1轉(zhuǎn)錄降低、DPD mRNA表達隨之下調(diào)，顯示DPD mRNA與PER1 mRNA表達呈正相關(guān)，提示DPD轉(zhuǎn)錄受內(nèi)源性細胞時鐘控制[43]。由此可見，生物鐘分子機制被擾亂，會導致骨代謝標志物分泌異常，干擾成骨細胞和破骨細胞功能，打破骨代謝動態(tài)平衡。

3.2 骨代謝異常擾亂機體正常的晝夜節(jié)律

骨代謝異常使核心鐘基因正常表達節(jié)律也被擾亂，從而導致生物鐘晝夜節(jié)律紊亂。通過研究時鐘基因與垂體前葉細胞中BMP4的相互作用，證實BMP4可以抑制PER2的表達[44]。研究發(fā)現(xiàn)骨性下頜骨發(fā)育不全患者體內(nèi)Bmal1的表達下調(diào)，Bmal1敲除小鼠OPG表達減少，體外外源補充OPG顯著逆轉(zhuǎn)了由Bmal1敲低引起的破骨細胞分化增強，通過腹膜內(nèi)注射OPG可部分逆轉(zhuǎn)Bmal1基因敲除引起的骨質(zhì)流失[45]。腫瘤骨轉(zhuǎn)移可能會導致骨代謝標志物晝夜振幅降低，甚至失去晝夜變化。一項研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后乳腺癌骨轉(zhuǎn)移婦女和健康對照組相比，OC只在健康對照組有明顯的晝夜節(jié)律[46]。晚期胃腸癌患者的DPD mRNA表達沒有表現(xiàn)出晝夜節(jié)律[32]?？梢姰惓５墓谴x也在分子和基因水平影響著生物鐘的變化。

綜上所述，多種生物體內(nèi)骨代謝標志物大都具有晝夜節(jié)律性，且大都呈現(xiàn)夜晚高峰而日間低谷的節(jié)律性，表明無論是骨形成還是骨吸收，多在夜間進行。但是由于各種變異因素使研究者對單個骨轉(zhuǎn)換標志物的晝夜節(jié)律性得出不同甚至矛盾的結(jié)論，其變異的來源是多方面的，包括飲食因素、技術(shù)因素、年齡、性別、疾病、生活方式及環(huán)境因素。骨代謝與晝夜節(jié)律之間具有雙向交互作用，異常的骨代謝可擾亂晝夜節(jié)律，導致鐘基因的表達異常，其中Bmal1的變化最為明顯，表明Bmal1基因多方面參與了骨代謝的病理功能；紊亂的晝夜節(jié)律又進一步抑制骨形成、加速骨吸收，形成惡性循環(huán)。目前來說，對骨代謝晝夜節(jié)律的研究仍然存在一些不足，如缺乏單個鐘基因與單個骨代謝標志物因子的相關(guān)性的研究，缺乏對多種疾病狀態(tài)下的骨代謝標志物節(jié)律變化的研究，缺乏晝夜節(jié)律紊亂對骨健康的影響在男性和女性之間的研究。由于數(shù)據(jù)缺乏，大多數(shù)骨代謝標志物只能作為隊列研究的篩查工具，無法獨立于骨密度作為診斷或預后工具，預測骨折風險，在臨床實踐中尚未被廣泛采用。未來可能需要更嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計以及大樣本多中心多種生物多種樣本的實驗，并綜合考慮各項指標的敏感性、特異性、檢測方法、變異性、影響因素和合并疾病等。此外，骨代謝標志物晝夜節(jié)律形成的機制及其與鐘基因之間的生理、病理聯(lián)系是未來的研究重點，可為時間藥物治療提供有力的循證醫(yī)學證據(jù)。