張新鵑 邢冬杰 王海鳳 李春英 李 麗 劉曉慶

（1.山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校 西醫(yī)教學(xué)部，山東 煙臺(tái) 264199；2.牟平區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 糖尿病腎病科，山東 煙臺(tái) 264100）

糖尿病是世界各國(guó)最常見(jiàn)的慢性疾病之一，發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中2型糖尿病的患病人數(shù)約占糖尿病患者總數(shù)的90%[1]。2型糖尿病嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，為進(jìn)一步研究2型糖尿病的病因、發(fā)病機(jī)制，探討更有效的治療方法，教學(xué)科研中需要大量的2型糖尿病動(dòng)物模型進(jìn)行基礎(chǔ)研究[2]。因此，制備2型糖尿病動(dòng)物模型具有重要意義。早在100多年前，國(guó)外學(xué)者采用切除狗胰腺的方法建立了糖尿病模型，這是歷史上最早的糖尿病動(dòng)物模型。后來(lái)，科學(xué)研究中制備2型糖尿病動(dòng)物模型的動(dòng)物種類(lèi)和方法越來(lái)越多，但是到目前為止還沒(méi)有完全統(tǒng)一的模型制備方法[3]。本實(shí)驗(yàn)正是為制備2型糖尿病動(dòng)物模型提供有效方案，從而為2型糖尿病的教學(xué)及科研提供成功的動(dòng)物模型。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠26只，12周齡，體質(zhì)量（242.31±16.23）g，購(gòu)于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)監(jiān)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。

2.試劑及飼料

鏈脲佐菌素（STZ），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（PH4.4）購(gòu)自煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司；大鼠基礎(chǔ)飼料及高脂高糖飼料均購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，高脂高糖飼料配比為：10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽+66.5%基礎(chǔ)飼料。

3.實(shí)驗(yàn)方法

參照張本天等人的研究方法喂養(yǎng)[4]：大鼠基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，所有大鼠稱(chēng)體質(zhì)量，按照隨機(jī)數(shù)字表法選取10只為正常組，給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)4w；剩下的作為造模組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4w。所有大鼠每天稱(chēng)體質(zhì)量，先按 12g/100g體質(zhì)量給食，觀察大鼠進(jìn)食情況進(jìn)行食物/體質(zhì)量比例的調(diào)整，使兩組大鼠體質(zhì)量以接近的速度增長(zhǎng)。所有大鼠都自由飲水，每日更換一次墊料。

所有大鼠禁食不禁水12h，稱(chēng)體質(zhì)量、測(cè)血糖。造模組大鼠按35mg·kg-1劑量稱(chēng)取STZ配制STZ溶液，溶液配制操作應(yīng)在冰浴中完成，即STZ粉末、檸檬酸緩沖液、STZ溶液均應(yīng)放在冰浴中。STZ溶液在 10min 內(nèi)通過(guò)腹腔注射入大鼠體內(nèi)。大鼠注射完成后應(yīng)觀察 2 h 左右，給予充足飲水和食物。正常組大鼠繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠繼續(xù)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，飲水自由，每日更換一次墊料。

4.觀測(cè)指標(biāo)

4.1 大鼠一般情況

第1w、5w、7w末，禁食不禁水12h，稱(chēng)取正常組及造模組大鼠空腹體質(zhì)量，并觀察兩組大鼠的毛發(fā)光澤度、攝食、飲水及尿量的改變。

4.2 空腹血糖

注射STZ后第3、7、10、13d，禁食不禁水12h，斷尾取血，以羅氏血糖儀測(cè)空腹血糖（FBG）。以FBG≥16.7mmol·L-1并穩(wěn)定10d為造模成功。成模后分別測(cè)定正常組及造模組大鼠的空腹血糖。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（`x±s）形式表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用配對(duì) t 檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.造模成功率

造模組大鼠16只，造模成功13只，造模成功率為81.25%。

2.大鼠一般情況的比較

造模前（第1w末）正常組大鼠體質(zhì)量為（258.88±13.71）g，造模大鼠體質(zhì)量為（256.83±10.80）g，兩者無(wú)顯著性差異（t=0.534；P=0.595）。正常組及造模大鼠攝食、飲水及二便均正常，活潑好動(dòng)，體毛順滑有光澤；高脂高糖飼料喂養(yǎng)4w后（第5w末）正常組大鼠體質(zhì)量為（328.66±15.80）g，造模大鼠體質(zhì)量為（345.97±12.96）g，兩者差異極顯著（t=-3.507；P=0.001）。造模組大鼠較正常組大鼠拉尿稍多，攝食、飲水及外觀習(xí)性無(wú)明顯差異；造模成功后（第7w末）成模大鼠與正常組相比出現(xiàn)攝食飲水及尿量明顯增多，活動(dòng)減少，體毛粗糙無(wú)光澤，體質(zhì)量降為（303.25±13.35）g，正常組體質(zhì)量為（337.83±11.35）g，兩者差異極顯著（t=7.641；P=0.000）。

3.大鼠空腹血糖的比較

正常組大鼠空腹血糖為 （5.62±0.47） mmol·L-1，造模組大鼠空腹血糖為（18.81±1.08） mmol·L-1，兩者差異極顯著（t=-35.329；P=0.013）。

三、討論

目前制備2型糖尿病大鼠模型的方法主要有自發(fā)性動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型，但前兩者由于來(lái)源較少、飼養(yǎng)和繁殖條件要求嚴(yán)格、動(dòng)物價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，限制了其在教學(xué)科研中的廣泛應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外最常用的是實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型[5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常組相比，造模組大鼠體質(zhì)量下降、空腹血糖升高、攝食飲水及尿量明顯增多。這些變化均符合2型糖尿病的病理生理特點(diǎn)，是合格的2型糖尿病動(dòng)物模型。

STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型可有效模擬糖尿病的病程及發(fā)病機(jī)理，并降低動(dòng)物模型的死亡率，是研究進(jìn)行性糖尿病的發(fā)病機(jī)理及并發(fā)癥較理想的模型[6]。STZ對(duì)胰島β細(xì)胞具有高度選擇性毒性作用，可以通過(guò)自由基損傷胰島β 細(xì)胞，使胰島分泌功能受損甚至喪失，使糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝失調(diào)，從而引起糖尿病[7]。因體質(zhì)量較輕、器官發(fā)育未成熟的大鼠一次性注射STZ劑量過(guò)大時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡率很高[4]，所以前期把大鼠飼養(yǎng)一段時(shí)間，待大鼠體質(zhì)量達(dá)到300g左右時(shí)再行注射小劑量STZ溶液（35mg·kg-1）進(jìn)行模型構(gòu)建可成功制備2型糖尿病大鼠模型。本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠4w左右，這時(shí)的大鼠器官已基本發(fā)育成熟且體質(zhì)也較適宜，加之考慮到大鼠的實(shí)際年齡及科研中后續(xù)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排，建議科研實(shí)驗(yàn)中大鼠高脂高糖飼料的喂養(yǎng)時(shí)間最好為4 w左右。

高脂高糖飲食是2型糖尿病及胰島素抵抗發(fā)生的重要因素[8]。目前研究認(rèn)為，糖毒性、脂毒性等因素會(huì)誘發(fā)胰島的慢性炎癥反應(yīng)[9]，是胰島β細(xì)胞功能受損的主要原因[10]。本實(shí)驗(yàn)高脂高糖飼料的配比為：10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鹽+66.5%基礎(chǔ)飼料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該配比的高脂高糖飼料可以用于制備2型糖尿病大鼠模型，可供科研及教學(xué)工作者日后參考使用。

本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠 4w左右，大鼠禁食不禁水12h，稱(chēng)重后一次性左下腹注射35mg·kg-1STZ溶液制備2型糖尿病大鼠模型可獲得較高的成模率。但在實(shí)際科研實(shí)驗(yàn)中，2型糖尿病大鼠模型的成模率會(huì)受到很多因素影響，實(shí)驗(yàn)室條件、實(shí)驗(yàn)人員操作等因素都可能造成結(jié)果不同。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各方面條件及操作步驟都應(yīng)該嚴(yán)格把控，這樣才能保證2型糖尿病大鼠模型制備的有效性和成功率。