趙雪瑤,李大偉

(1.北華大學(xué),吉林 吉林 132113;2北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132113)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染性疾病是由各種病原微生物侵犯腦實質(zhì)、血管及被膜引起的神經(jīng)系統(tǒng)重癥疾病，具有高病死率和致殘率等特點。因病原微生物檢測手段有限，極易延誤診斷及治療。宏基因組下一代測序(mNGS)基于大規(guī)模并行測序原理，利用多個DNA小片段平行測序來確定序列[1]，可同時檢測樣本中全部病原微生物，對于CNS感染性疾病病原學(xué)診斷與鑒別診斷具有重要意義。本文綜述近幾年mNGS應(yīng)用于CNS感染性疾病病原學(xué)診斷的相關(guān)文獻(xiàn)，比較其在應(yīng)用中的利弊，幫助臨床醫(yī)生提高對mNGS技術(shù)和其在診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中應(yīng)用的認(rèn)識。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)重癥疾病，早期診斷、及時治療對改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床常用腦脊液病原學(xué)檢測方法主要有：涂片鏡檢、病原菌培養(yǎng)、抗原抗體檢測及分子生物學(xué)檢測。涂片法雖然操作簡便，但敏感性低；培養(yǎng)法是病原學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時較長，不利于早期診斷；抗原抗體檢測及分子生物學(xué)檢測是目前臨床中應(yīng)用較廣泛檢測方法，但其診斷敏感度也僅能達(dá)到40%～50%。病原學(xué)診斷困難是制約CNS感染性疾病早期診治主要障礙。

宏基因組下一代測序(mNGS)是一種DNA測序技術(shù)，基于大規(guī)模并行測序原理，在不需要靶基因前提下對樣本中全部核酸進(jìn)行提取、測序，并進(jìn)行成像及數(shù)據(jù)分析[1]。隨著基因測序技術(shù)發(fā)展，mNGS已廣泛應(yīng)用于全基因組測序、基因組多樣性研究、宏基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、非編碼RNA和蛋白質(zhì)結(jié)合位點研究以及RNA測序基因表達(dá)譜分析[2]。由于mNGS是無針對性對樣本中全部基因組進(jìn)行測序，檢測樣本中全部病原微生物，與傳統(tǒng)腦脊液診斷技術(shù)相比，不僅具有高敏感度優(yōu)勢，更具有無偏性特點[3]，這對CNS感染性疾病診斷與鑒別診斷十分重要。

1 mNGS檢測原理

基因測序技術(shù)最早由Sanger和Coulson于1975年首次提出并研發(fā)，被稱為第一代測序技術(shù)。其基本原理是在所需核酸序列任一側(cè)應(yīng)用寡核苷酸引物，添加DNA聚合酶和核苷酸“構(gòu)建塊”混合物，使延長的核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，生成一系列不同拷貝“鏈終止”產(chǎn)物，然后在凝膠或毛細(xì)管系統(tǒng)上通過電泳分離出來并進(jìn)行檢測。宏基因組下一代測序是基于大規(guī)模并行測序原理，可同時對成千上萬DNA片段進(jìn)行測序。主要包括：①文庫制備：將DNA分成多個短片段，并在這些小片段兩端添加上不同接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫；②應(yīng)用不同方法進(jìn)行DNA片段分離并擴增，形成不同DNA簇；③測序及分析。目前臨床中常用的二代測序平臺為illumina(舊稱Solexa)和454方法(也稱為Roche FLX)，雖然不同測序技術(shù)使用方法不同，但基本原理相似[4]。與一代測序相比，具有高效低成本優(yōu)勢，使得測序技術(shù)能夠在臨床中廣泛應(yīng)用。

2 NGS在腦脊液病原診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1CNS病毒感染：病毒性腦炎是臨床中常見的CNS感染性疾病，可通過腦脊液病毒抗體檢測、PCR檢測進(jìn)行病原學(xué)診斷。因病原體多樣性，傳統(tǒng)腦脊液檢測方法敏感性有限。mNGS在CNS病毒感染診斷中已取得了一定進(jìn)展，文獻(xiàn)報道對常見病原菌檢測有效，如單純皰疹病毒1型、2型、3型(HSV-1、hsv-2、HSV-3)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、柯薩奇A9病毒等[5-9]。mNGS可在不使用任何引物或探針情況下對樣本全部核酸進(jìn)行擴增和測序[10]，其優(yōu)勢不僅體現(xiàn)在常規(guī)病毒檢測，更體現(xiàn)在罕見病毒的檢測。Julianne等人通過對病因不明腦炎病例進(jìn)行腦脊液病原學(xué)NGS檢測研究[11]中，發(fā)現(xiàn)2例人細(xì)小病毒4 (PARV4)病例；1例人類冠狀病毒OC-43病例；1例人星狀病毒MLB1病例及1例腮腺炎疫苗病毒感染病例。盡管對于此類病毒致病性仍有爭議，但此檢測方法無疑為腦脊液病原學(xué)診斷帶來了新的可能。

除腦脊液病原學(xué)檢測，mNGS技術(shù)在診斷病毒學(xué)方面還有許多潛在應(yīng)用，如發(fā)現(xiàn)和鑒定未知病毒、超靈敏監(jiān)測抗病毒藥物耐藥性、研究病毒多樣性、進(jìn)化和傳播等[12-13]。2020年新型冠狀病毒橫掃全球，盡管目前新冠病毒侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)病例罕有報導(dǎo)，但也為我們敲響警鐘，病毒相關(guān)性疾病千變?nèi)f化，及時診斷對于疾病治療及遏制傳播至關(guān)重要。隨著測序技術(shù)發(fā)展，mNGS將成為應(yīng)對新發(fā)疾病有效手段。

2.2CNS細(xì)菌感染：細(xì)菌感染亦是CNS常見感染類型，病情多兇險，致死致殘率高。迄今為止，已有數(shù)百種病原微生物被證實可引起此類疾病。由于檢測手段有限，且抗感染藥物濫用，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)陽性率較低，尤其對未知病原體或混合感染識別較差。快速準(zhǔn)確病原菌鑒定，并給予針對病原菌精準(zhǔn)抗感染治療是困擾臨床工作的重大問題。mNGS檢測可獲得樣品全部基因組信息，并可通過16srRNA基因分析進(jìn)行細(xì)菌種類鑒定和分類學(xué)研究，有效檢測和鑒定常見及罕見病原菌[14]。同時mNGS有助于驗證常規(guī)方法檢測結(jié)果，檢測是否存在合并感染及感染類型，尤其是在接受高級預(yù)防性抗生素治療的患者中[15]。在一項診斷小兒CNS細(xì)菌感染研究中指出，mNGS具有較高敏感性，使病原菌檢出陽性率提高13.1%(病原菌檢出陽性率由55.6%提高到68.7%)[16]。在尚晶等人研究[17]中發(fā)現(xiàn)，腦脊液mNGS病原學(xué)檢出率為53.33%，與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時在Aicui等人研究[18]結(jié)果表明，腦脊液細(xì)菌種類復(fù)雜，61.5%標(biāo)本呈混合病原感染，mNGS對于混合感染病原菌鑒定有絕對優(yōu)勢。綜上所述，mNGS不僅可提高CNS細(xì)菌感染診斷率，同時對混合感染鑒別及指導(dǎo)下一步治療，均有重要意義。

2.3CNS結(jié)核感染：目前，結(jié)核病在全世界范圍仍廣泛流行，CNS結(jié)核感染嚴(yán)重危害著人類健康。由于結(jié)核菌特殊性，常規(guī)病原學(xué)檢測方法敏感度有限，且耗時長，早期診斷困難，進(jìn)而延誤治療使預(yù)后不佳。近年來更多證據(jù)表明，mNGS檢測CNS結(jié)核，其總敏感性為66.7%～84.4%，特異性為96.4%～100%[19-21]。與其他腦脊液結(jié)核分枝桿菌相關(guān)檢測相比，mNGS具有較高檢出率[20]。盡管mNGS對腦脊液結(jié)核分枝桿菌檢測敏感度高，但仍存在一定局限性，首先其陰性預(yù)測值(NPV)僅為46.5%[21]，未達(dá)到排除臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；其次對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測，不如傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法(如Xpert等)成熟；此外，由于成本較高，且對檢測人員技術(shù)及實驗室要求較高，目前在中低發(fā)達(dá)地區(qū)開展困難，因此限制了其在CNS結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。

2.4CNS真菌感染：CNS真菌感染常見于免疫缺陷患者，近年來健康成人感染報道亦逐漸增多。CNS真菌感染類型最常見的為新型隱球菌。王芳等人對7例新型隱球菌腦膜炎患者，進(jìn)行相關(guān)檢查，其中隱球菌莢膜抗原檢測陽性5例(71.4%)，墨汁染色陽性3例(42.9%)，培養(yǎng)陽性2例(28.6%)，mNGS陽性3例(42.9%)，mNGS敏感性與墨汁染色相近[22]。而葛瑛等人對6例新型隱球菌腦膜炎患者進(jìn)行腦脊液檢測，5例患者mNGS陽性[23]。從目前研究中可以發(fā)現(xiàn)，mNGS對于真菌檢測敏感度與傳統(tǒng)檢測方法無明顯差異，可能是由于樣本量較小所致。但mNGS可以檢測樣本中全部病原微生物，能夠在早期對腦脊液樣本中真菌類型進(jìn)行鑒別，對于臨床精準(zhǔn)治療，提高療效有非常重要的意義。

2.5罕見感染鑒定：對于常見CNS感染性疾病，常規(guī)病原學(xué)檢測手段雖然陽性率較低，但仍可通過患者臨床表現(xiàn)及實驗室輔助檢查進(jìn)行綜合判斷分析，經(jīng)驗性診斷治療。而對于布魯桿菌病、螺旋體、寄生蟲等感染病例，僅能在專科醫(yī)院進(jìn)行檢查鑒別，常會導(dǎo)致誤診及延誤治療。多項研究表明，mNGS對于布魯氏桿菌感染[24-25]、囊蟲感染[26-27]具有較高檢出率。同時，對于臨床中罕見病原感染，mNGS更具優(yōu)勢。辛子凱及程楊等人報道[28-29]，應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷CNS李斯特菌感染，趙偉麗及Wang等人報道[30-31]了應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷CNS偽狂犬病毒感染，其他還有CNS Powassan病毒感染[32]、豬鏈球菌感染[33]、廣州管線原蟲感染[34]、諾卡菌感染[35]、曼陀羅拉木裂體感染[36]等報道。由此可見，mNGS是CNS少見病原菌感染性疾病的診斷有效檢測手段。

3 腦脊液mNGS檢測技術(shù)優(yōu)勢

①廣泛識別已知和少見病原體，甚至發(fā)現(xiàn)新的生物體[37]；②發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒，監(jiān)測抗病毒藥物耐藥性，并通過基因測序研究病毒多樣性、進(jìn)化和傳播等[12-13]；③同時進(jìn)行多種病原菌檢測，是混合感染和CNS感染鑒別診斷有效手段[18]；④腦脊液作為無菌體液，污染可能性較其他樣本低，因此mNGS檢測更具有臨床診斷意義。

4 現(xiàn)階段面臨問題

4.1mNGS檢測假陰性問題：李霞等人研究[38]指出，mNGS假陰性原因主要有：①采樣環(huán)節(jié),如病原載量過低等；②儲存或運輸過程,如未嚴(yán)格-20℃低溫凍存致核酸降解；③實驗環(huán)節(jié),如真菌破壁效率較低,影響真菌檢出率；④數(shù)據(jù)庫不完善,如新發(fā)病原體未包含在數(shù)據(jù)庫中；⑤mNGS方法學(xué)原理不完善,如人源序列比例過高等。而在Qian等人研究[15]中指出，預(yù)先使用抗生素也可造成mNGS檢測結(jié)果假陰性。由此可見，多個環(huán)節(jié)均可影響mNGS檢測結(jié)果。因此，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)實際情況，嚴(yán)格把握取材時間及總量，并嚴(yán)格規(guī)范操作流程，盡量減少假陰性發(fā)生。

4.2假陽性結(jié)果：假陽性結(jié)果可誤導(dǎo)或干擾臨床診斷，mNGS檢測臨床標(biāo)本中的微生物可以反映正常微生物群、瞬時定植菌、樣品污染或感染[3]。腦脊液雖然是常見無菌樣本，但仍不能排除污染可能，因此還需要進(jìn)一步研究，以尋求區(qū)分定植和感染最佳方法。

4.3新微生物鑒定：對于新微生物檢測，mNGS具有強大診斷效能。然而，在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)一種新病原體或一組不尋常微生物只表明其潛在致病作用，并不能確定其與疾病因果關(guān)系[39]。因此，對于檢測結(jié)果中新微生物或罕見微生物，是否為此次感染致病微生物，仍需根據(jù)此病實際情況，進(jìn)行綜合分析。

4.4目前已有研究致力于解決mNGS人源DNA污染排除問題[40]，如該問題能夠得到徹底解決，病原學(xué)檢測準(zhǔn)確率會跨越式發(fā)展。

4.5mNGS檢測可能會漏掉不存在或短暫存在于腦脊液中的病原菌(如伯士疏螺旋體、神經(jīng)梅毒)。因此對于mNGS陰性結(jié)果且仍對診斷存在疑問病例，建議聯(lián)合血液學(xué)mNGS檢測，進(jìn)行綜合診斷[41]。

5 小結(jié)

隨著測序技術(shù)發(fā)展，mNGS技術(shù)已趨于成熟，對于腦脊液病原體檢測率明顯提高，但其敏感度仍不足以滿足臨床診斷需要?，F(xiàn)階段可以通過改進(jìn)樣本處理、提取、擴增和測序方法，來提高mNGS病原菌檢測敏感度[42]。首先，開發(fā)新標(biāo)本處理方法，改進(jìn)病原菌富集和捕獲方式，尤其對于胞內(nèi)寄生菌，有效破壁方案是提取病原菌重要步驟。其次，高效提取核酸進(jìn)行擴增，盡可能排除人源性核酸及其他定植菌污染，也是提高敏感度重要方法。最后，需不斷完善DNA文庫，提供廣泛覆蓋范圍，提高數(shù)據(jù)分析能力，進(jìn)一步提高檢測敏感度[15]。mNGS技術(shù)目前已開始廣泛應(yīng)用于CNS感染檢測，隨著該技術(shù)的不斷改進(jìn)，將促進(jìn)CNS感染病原學(xué)診斷，為疾病診治提供理論依據(jù)，更好地為臨床服務(wù)。