余建華 張艷洪 鄒小鳳 朱文婷 李 鑫 陳美琪

1.廣東省東莞康華醫(yī)院血液病中心實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 532080；2.廣東省東莞康華醫(yī)院腫瘤科，廣東東莞 532080；3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510515

感染性疾病是臨床常見疾病之一，該病起病急、進(jìn)展快，且臨床上不同病原體所致的感染其臨床表現(xiàn)常不易甄別，常導(dǎo)致診治困難。病原菌未及時(shí)清除，感染進(jìn)展常導(dǎo)致患者多器官功能衰竭而死亡。因此，早診、早治，對(duì)感染治療尤為重要，有助于改善預(yù)后。研究顯示，中性粒細(xì)胞CD64 指數(shù)（nCD64 index）可用于診斷細(xì)菌感染，且不受激素、抗生素和感染部位的影響[1-4]；單核細(xì)胞HLA-DR（mHLA-DR）在細(xì)菌感染時(shí)降低，而在病毒感染時(shí)明顯升高[5-6]。聯(lián)合檢測(cè)nCD64 index 和mHLA-DR 在感染性疾病中的研究報(bào)道較少[7]。本研究旨在探討利用流式術(shù)檢測(cè)外周血nCD64 index和mHLA-DR 表達(dá)水平在感染性疾病診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年1 月—11 月在東莞康華醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）診治的74 例發(fā)熱患者的臨床資料，根據(jù)病因分為兩組，其中40 例膿毒癥患者作為細(xì)菌感染組，男24 例，女16 例，年齡21～93 歲，平均（51.55±17.19）歲；其他登革熱患者34 例作為病毒感染組，男16 例，女18 例，年齡21～80 歲，平均（49.12±18.01）歲。選取我院同期健康體檢者40 名作為健康對(duì)照組，男19 名，女21 名，年齡17～85 歲，平均（47.00±18.97）歲。三組性別及年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)菌感染組臨床診斷為膿毒癥，且血培養(yǎng)和/或無菌體液培養(yǎng)陽性；②病毒感染組臨床診斷為登革熱，登革病毒IgM 抗體和/或登革病毒NS1 抗原檢測(cè)陽性[8]。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑

采用貝克曼庫(kù)爾特Navios 型流式細(xì)胞儀，使用抗體試劑名稱：CD45-FITC、CD14-PE、CD64-PE-cy5、CD19-PE-cy7、HLA-DR-Pacific Blue。開機(jī)時(shí)用Flow-Check 微球進(jìn)行光路和液流的校準(zhǔn)，保證儀器在檢測(cè)期間具有良好的運(yùn)行狀態(tài)。

1.3 檢測(cè)方法

CD64 和HLA-DR 采用EDTA 抗凝靜脈血上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，依次取50 μL 全血，加上述抗體各2 μL，混勻、室溫避光孵育抗體15 min，加1.5 mL NH4Cl 紅細(xì)胞裂解液作用10 min，再300g離心5 min棄上清，加100 μL PBS 重懸上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)方案及數(shù)據(jù)分析見圖1。nCD64 index=[中性粒細(xì)胞CD64 的平均熒光強(qiáng)度（nCD64）/淋巴細(xì)胞CD64 的平均熒光強(qiáng)度（Ly-CD64）]/[單核細(xì)胞CD64 的平均熒光強(qiáng)度（mCD64）/nCD64][1]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，三組比較用單因素方差檢驗(yàn)。計(jì)量資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。偏態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，三組比較用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用受試者工作曲線（ROC）分析各指標(biāo)鑒別感染的診斷價(jià)值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組人群CD64 和HLA-DR 指標(biāo)表達(dá)水平比較

圖1 檢測(cè)方案及數(shù)據(jù)分析流程

三組人群nCD64、mCD64、nCD64 index、nHLADR、mHLA-DR、bHLA-DR、mHLA-DR+（%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)菌感染組nCD64 和nCD64 index 水平高于健康對(duì)照組和病毒感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。病毒感染組nHLA-DR、mHLADR 和mHLA-DR+（%）顯著高于健康對(duì)照組和細(xì)菌感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 nCD64、nCD64 index、mHLA-DR 和mHLA-DR+（%）單獨(dú)檢測(cè)對(duì)細(xì)菌與病毒性感染診斷的效能評(píng)價(jià)

nCD64 index 的曲線下面積顯著高于nCD64、mHLADR+（%）、mHLA-DR，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各指標(biāo)的截?cái)嘀捣謩e是0.53、30.8、325 和93.9%。各指標(biāo)ROC 曲線和曲線下面積見表2、圖2。

2.3 CD64 和HLA-DR 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)細(xì)菌與病毒性感染診斷的效能評(píng)價(jià)

nCD64 index 與mHLA-DR 聯(lián)合檢測(cè)ROC 曲線下面積最大為0.791，靈敏度（95.00%）和特異度（94.12%）。各聯(lián)合檢測(cè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

表1 三組人群CD64 和HLA-DR 表達(dá)水平比較[M（P25，P75）]

表2 CD64 和HLA-DR 各檢測(cè)指標(biāo)ROC 曲線下面積及診斷效能評(píng)價(jià)

圖2 CD64 和HLA-DR 各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)感染的ROC 分析曲線

3 討論

早期識(shí)別感染性疾病的發(fā)生，針對(duì)致病微生物實(shí)施合理治療，對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義[9]。而細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)陽性率低，病毒分離耗時(shí)長(zhǎng)，無法指導(dǎo)早期治療決策的制訂[10]。臨床常用的感染輔助診斷指標(biāo)：白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原等，存在特異性低、易受治療用藥影響等局限性[11-12]。

CD64 是免疫球蛋白IgG 的Fc 段Ⅰ型受體，主要分布于單核、巨噬和樹突細(xì)胞表面，其表達(dá)受細(xì)胞因子的調(diào)控[13]。生理狀態(tài)下中性粒細(xì)胞表面CD64（nCD64）低表達(dá)，當(dāng)受到細(xì)胞因子刺激，nCD64 表達(dá)4～6 h 迅速上調(diào)10 倍，22 h 達(dá)到高峰[14]。nCD64 表達(dá)穩(wěn)定，4℃可保存72 h，且不易受糖皮質(zhì)激素[15]和抗生素的干擾[1]。當(dāng)除去刺激因素時(shí)，nCD64 表達(dá)逐步降低，并在7 d 內(nèi)恢復(fù)正常[16]。本研究結(jié)果顯示在病毒感染時(shí)mCD64 明顯升高，nCD64 輕度升高；在細(xì)菌感染時(shí)mCD64 和nCD64 同時(shí)顯著增高[17-18]，nCD64 index綜合了mCD64 和nCD64 的變化，優(yōu)于nCD64 單獨(dú)報(bào)告。nCD64 index 的截?cái)嘀蹬c既往研究不同[2,19-21]，是由于在各實(shí)驗(yàn)室設(shè)置檢測(cè)方案時(shí)檢測(cè)熒光通道不同、儀器的電壓不同，導(dǎo)致本底陰性值（LyCD64）和陽性值（mCD64）不同，進(jìn)而nCD64 index 計(jì)算值不同。nCD64 index 與mHLA-DR 聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，結(jié)合兩者的優(yōu)勢(shì)，獲得最大曲線下面積及較高靈敏度和特異度（95.00%、94.12%）。因此，建議nCD64 index 與mHLADR 聯(lián)合檢測(cè)，并建立自己實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間。

圖3 nCD64 index 和mHLA-DR 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)感染ROC 分析曲線

HLA-DR 是外源性抗原肽遞呈和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中的重要蛋白分子，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、DC 細(xì)胞。mHLA-DR 表達(dá)持續(xù)降低是機(jī)體“免疫麻痹”的良好指標(biāo)[22]，可以預(yù)測(cè)感染預(yù)后及發(fā)生二次感染的風(fēng)險(xiǎn)[23-24]。因此，mHLA-DR 更適合用于疾病中后期監(jiān)測(cè)病情用[25-26]。

綜上所述，nCD64 index 和mHLA-DR 聯(lián)合檢測(cè)，有助于鑒別診斷細(xì)菌與病毒性感染，為臨床診治提供切實(shí)可靠的數(shù)據(jù)支持。