黃秀芳 原向偉 秦 英 陳忠羨

1.中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院（江門市中心醫(yī)院）病理科，廣東江門 529030；2.中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院（江門市中心醫(yī)院）脊柱骨科，廣東江門 529030

骨肉瘤是骨組織原發(fā)腫瘤中最常見的惡性腫瘤[1]，雖然發(fā)病率偏低，但其多發(fā)于青少年，惡性度極高，預(yù)后不佳[2]。順鉑常用于骨肉瘤患者的化療，但因耐藥和毒性作用等問題常影響其療效[3-4]。干擾素α（IFN-α）已用于治療多種腫瘤[5-6]，但其對骨肉瘤化療敏感性的影響罕有報道。本研究探討IFN-α 對人骨肉瘤U2OS細胞化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與試劑

U2OS 細胞來自中山大學(xué)病理學(xué)教研室，培養(yǎng)液為DMEM（GIBCO）[含10%胎牛血清（GIBCO）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素]，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。IFN-α 為Peprotech 產(chǎn)品；臺盼藍、順鉑購自Sigma；Z-VAD-FMK 為Calbiochem 產(chǎn)品；DNAzol 購自Invitrogen；Caspase-3（sc-7272）、Caspase-8（sc-56070）、Caspase-9（sc-56077）和GAPDH（sc-47724）等抗體購自Santa Cruz。

1.2 臺盼藍拒染法

細胞經(jīng)0.4%臺盼藍染色，藍染為死細胞，活細胞拒染，細胞生長抑制率=（對照組活細胞數(shù)－實驗組活細胞數(shù)）/對照組活細胞數(shù)×100%。

1.3 Hoechst 33258 熒光染色

U2OS 細胞4℃固定10 min 后1000 r/min 離心5 min，加Hoechst 33258 避光染15 min，熒光顯微鏡下計數(shù)細胞，凋亡率=凋亡細胞數(shù)/視野全部細胞數(shù)×100%。

1.4 DNA Ladder

U2OS 細胞加DNAzol，4℃，12 000 r/min 離心15 min，取上清加無水乙醇4℃，10 000 r/min 離心10 min；加75%乙醇清洗，溶于TE，瓊脂糖凝膠電泳成像。

1.5 Western blot

提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，TBST 4℃封閉過夜；一抗?jié)舛染鶠?∶1000 稀釋，室溫封膜3 h，二抗4℃過夜，ECL 發(fā)光，Image J 計算灰度，實驗重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α 對順鉑誘導(dǎo)U2OS 細胞生長抑制的影響

IFN-α 組（5000 U/mL）、順鉑組（5 μmol/L）、IFN-α+順鉑組細胞生長抑制率均高于對照組，IFN-α+順鉑組細胞生長抑制率高于順鉑組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

圖1 IFN-α 對順鉑誘導(dǎo)U2OS 細胞生長抑制的影響（n=3）

2.2 IFN-α 對順鉑誘導(dǎo)U2OS 細胞凋亡的影響

對照組、IFN-α 組細胞無明顯凋亡，順鉑組部分細胞出現(xiàn)凋亡變化如核濃染碎裂等，IFN-α+順鉑組凋亡細胞明顯增加，見圖2。對照組、IFN-α 組、順鉑組和IFN-α+順鉑組的細胞凋亡率分別為（1.63±1.03）%、（4.26±2.19）%、（17.85±3.66）%和（52.55±4.89）%，IFN-α+順鉑組細胞凋亡率高于順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=17.02，P<0.01）。

圖2 IFN-α 對順鉑誘導(dǎo)U2OS 細胞凋亡的影響（400×）

2.3 聯(lián)合用藥對DNA 梯形條帶的影響

DNA 梯形條帶是凋亡的特征性表現(xiàn)[7]，與其他組比較，IFN-α+順鉑組出現(xiàn)明顯梯形條帶。見圖3。

圖3 聯(lián)合用藥對DNA 梯形條帶的影響

2.4 IFN-α 對順鉑引起Caspase-3、8、9 表達的影響

在順鉑組，Caspase-3、8、9 僅有微弱的活化，而在IFN-α＋順鉑組，三者均出現(xiàn)明顯的活化裂解。見圖4。與順鉑組比較，IFN-α+順鉑組各活性片段的表達增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

2.5 聯(lián)合用藥的生長抑制依賴Caspase

經(jīng)泛Caspase 抑制劑Z-VAD-FMK 預(yù)處理后，IFN-α+順鉑+Z-VAD-FMK 組細胞生長抑制率低于IFN-α+順鉑組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5。

圖4 IFN-α 對順鉑引起Caspase-3、8、9 表達的影響

3 討論

IFN-α 通過JAK/STAT 通路發(fā)揮生物學(xué)功能[8-10]，可在胃癌、乳腺癌、肺癌、白血病中引起生長抑制和凋亡[11-14]，還增強放、化療引起的生長抑制[15-16]。聯(lián)合生物治療與其他治療，可望達到“1+1＞2”的療效[17-18]。本研究表明，IFN-α 明顯增強順鉑的生長抑制，提示了IFN-α 在骨肉瘤治療中的價值。雖然IFN-α 可抑制耐藥骨肉瘤細胞[5]，但其僅輕微抑制U2OS 細胞，這可能因為IFN-α 的抑制作用依賴ARF 基因[19]，而U2OS細胞中ARF 表達缺失[20]。

IFN-α 和順鉑均可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[21]，因此IFN-α 的增敏作用可能涉及凋亡。形態(tài)學(xué)和DNA ladder 表明IFN-α 的確通過凋亡增強U2OS 細胞對順鉑的敏感性。Caspase 是執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶[21]，Caspase-8、9 位于起始階段，兩者活化后裂解效應(yīng)性Caspase-3，信號逐級傳遞，直至完成凋亡[22-24]。本研究中Caspase-3、8、9 均出現(xiàn)明顯活化，證明IFN-α可能通過Caspase 級聯(lián)活化增強順鉑誘導(dǎo)的凋亡。而用泛Caspase 抑制劑Z-VAD-FMK 預(yù)處理可顯著減弱該效應(yīng)，表明其依賴于Caspase 的功能。而Caspase通常位于凋亡信號通路的末端，在其上游，必然存在IFN-α 誘導(dǎo)的起始因子改變，STAT 基因家族是候選因子之一[8]，相關(guān)研究尚需進一步深入。

表1 各組活化Caspase 蛋白的灰度分析（n=3）

圖5 聯(lián)合用藥的生長抑制依賴Caspase（n=3）

目前骨肉瘤仍缺乏有效的治療新方法[25]，IFN-α通過Caspase 依賴性凋亡增強骨肉瘤U2OS 細胞對順鉑的敏感性，提示聯(lián)合IFN-α 與傳統(tǒng)化療可能獲得更好的效果，相關(guān)研究值得進一步開展。