張婕妤，初亞男，封利穎，鄒秉杰（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，南京 210002）

巰嘌呤類藥物廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病，在炎癥性腸病和兒童急性淋巴細(xì)胞白血病等的治療中發(fā)揮重要作用[1-2]，但會(huì)引起致命的白細(xì)胞減少癥進(jìn)而導(dǎo)致治療中斷[3]。巰嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）是巰嘌呤類藥物代謝過(guò)程中的一種酶，其基因多態(tài)性與白細(xì)胞減少息息相關(guān)[4]。2005年美國(guó)FDA 推薦服藥前行TPMT分型檢測(cè)以降低不良發(fā)應(yīng)的發(fā)生[5]，但亞洲人TPMT突變頻率雖遠(yuǎn)低于歐洲人，白細(xì)胞減少的發(fā)生率卻比歐洲人高，因此可能存在其他因素[6-7]。韓國(guó)學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)NUDT15（nucleoside diphophate-linked moiety X-type motif 15，核苷二磷酸連接的部分X 型基序15）R139C 基因多態(tài)性（rs116855232）與白細(xì)胞減少密切相關(guān)，靈敏度和特異性高達(dá)89.4%和93.2%，靈敏度遠(yuǎn)高于TPMT的12.1%[8]。隨后中國(guó)和日本等亞洲國(guó)家的大量學(xué)者證實(shí)了NUDT15多態(tài)性對(duì)巰嘌呤類藥物引起的白細(xì)胞減少的預(yù)測(cè)意義[9-10]?！吨袊?guó)炎癥性腸病治療藥物檢測(cè)專家共識(shí)意見》建議在有條件的情況下，使用巰唑嘌呤類藥物前可進(jìn)行NUDT15基因多態(tài)性檢測(cè)[11]。臨床檢驗(yàn)中心要求檢驗(yàn)項(xiàng)目在引入臨床常規(guī)實(shí)踐前應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)性能評(píng)價(jià)，基因多態(tài)性檢測(cè)的方法層出不窮，焦磷酸測(cè)序是一種準(zhǔn)確性高的方法，但尚無(wú)焦磷酸測(cè)序檢測(cè)NUDT15基因多態(tài)性的方法學(xué)評(píng)價(jià)。本文旨在建立焦磷酸測(cè)序檢測(cè)NUDT15R139C 基因多態(tài)性的方法并進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床合理使用巰嘌呤類藥物提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料

1.1 一般資料

隨機(jī)挑選在本院進(jìn)行藥物基因組學(xué)檢測(cè)人群的EDTA-K2抗凝靜脈全血中提取的基因組DNA（濃度≥20 ng·μL－1，A260/A280在1.8～2.0），倫理批件號(hào)：2018NZGKJ-067。

1.2 儀器

A200 基因擴(kuò)增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；Q24 焦磷酸測(cè)序儀（德國(guó)QIAGEN 公司）。

1.3 試藥

TakaRa Taq擴(kuò)增試劑盒（日本Takara 公司）；焦磷酸測(cè)序試劑盒（德國(guó)QIAGEN 公司）；Streptavidin SepharoseTMHigh Performance（美 國(guó)GE Healthcare Life Sciences 公司）；水為蒸餾水。所有引物由上海Invitrogen 公司合成。

2 方法

2.1 PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系體積為50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol·L－1dNTPs 3 μL，25 mmol·L－1MgCl24 μL，Taq 酶0.25 μL，10 μmol·L－1上下游引物各2 μL，蒸餾水32.75 μL，基因組DNA 1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃/57℃/60℃ 30 s，72℃ 30 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

2.2 焦磷酸測(cè)序

取20 μL PCR 產(chǎn)物與2 μL Sepharose、40 μL binding buffer 和18 μL 蒸餾水混合，振蕩孵育8 min，將其制備成單鏈放在24 孔板中，孔板提前加1 μL 10 μmol·L－1的測(cè)序引物和24 μL annealing buffer，85℃解鏈1 min，降溫至室溫，放入焦磷酸測(cè)序儀中。核苷酸序列推注順序?yàn)椤癈CTTGT”，其中第一個(gè)“C”為野生型信號(hào)峰，第二個(gè)“C”為CMP 的測(cè)序本底，第一個(gè)“T”為突變型信號(hào)峰，第二個(gè)“T”為TMP 的測(cè)序本底。根據(jù)儀器分析結(jié)果或者熒光信號(hào)峰的比例判斷型別。

2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩獨(dú)立樣本比較采用雙樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)；Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 方法建立

從PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)中的SNP 欄中找到NUDT15R139C 的人源基因組序列，利用PyroMark Assay Design 軟件設(shè)計(jì)出評(píng)分最高的兩組引物序列。具體引物序列見表1，共用一條測(cè)序引物。挑選一例雜合型基因組DNA 樣本，分別在55℃、57℃和60℃條件下退火，重復(fù)檢測(cè)7 次。比較不同退火溫度條件下的熒光信號(hào)值，發(fā)現(xiàn)第一套引物在57℃時(shí)信號(hào)最高，因此選用第一套引物和57℃退火溫度為NUDT15分型的焦磷酸測(cè)序最佳條件（見表2）。

表1 檢測(cè)NUDT15 R139C 基因多態(tài)性的引物序列Tab 1 Sequence of primers used for genotyping NUDT15 R139C polymorphism

表2 不同條件下焦測(cè)序熒光信號(hào)值(±s)Tab 2 Fluorescence signals detected by pyrosequencing under different conditions (±s)

表2 不同條件下焦測(cè)序熒光信號(hào)值(±s)Tab 2 Fluorescence signals detected by pyrosequencing under different conditions (±s)

來(lái)源 退火溫度/℃ 熒光信號(hào)值 P 值第一套 55 190±10 0.001 57 213±7 －60 197±22 0.114第二套 55 111±8 ＜0.001 57 116±14 ＜0.001 60 113±6 ＜0.001

3.2 靈敏度評(píng)價(jià)

將NUDT15雜合型DNA 樣本按梯度分別稀釋到10、2 和0.4 ng·μL－1，每管加1 μL 模板，空白管加DNA 溶解液，最低能檢測(cè)0.4 ng 基因組DNA（見圖1）。

圖1 不同量NUDT15 雜合型基因組DNA 的檢測(cè)結(jié)果Fig 1 Detection of different amounts of NUDT15 heterozygote genomic DNA

3.3 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

由于未檢出NUDT15純突變TT 型，因此隨機(jī)挑選經(jīng)焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證的CC 野生型11 例和CT 雜合型9 例，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司Sanger 測(cè)序，比較兩種測(cè)序方法的結(jié)果（見表3）。兩種測(cè)序結(jié)果符合率100%，焦磷酸測(cè)序方法的準(zhǔn)確度為100%。將Sanger 測(cè)序得到的序列信息經(jīng)PubMed blast 序列比對(duì)后，確定為人源NUDT15基因序列。

表3 焦測(cè)序和Sanger 測(cè)序檢測(cè)NUDT15 基因型的結(jié)果比較Tab 3 NUDT15 genotype detected by pyrosequencing and Sanger sequencing

3.4 重復(fù)性評(píng)價(jià)

選取兩種分型的基因組DNA 樣本各1 例，在不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)3 次，檢測(cè)結(jié)果完全一致，重復(fù)性符合要求。

3.5 臨床樣本檢測(cè)

按“3.1”項(xiàng)下最優(yōu)條件對(duì)臨床45 例樣本進(jìn)行NUDT15分型檢測(cè)，共檢出CC野生型33 例（73.3%），CT 雜合型12 例（26.7%），未檢出純突變型樣本，符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。

4 討論

硫唑嘌呤及其衍生物6-巰基嘌呤等嘌呤類藥物作為免疫抑制劑被廣泛用于炎癥性腸病、兒童急性淋巴細(xì)胞白血病等治療中，但其致命性的骨髓抑制不良反應(yīng)限制了其使用[3]。從療效和不良反應(yīng)來(lái)看，嘌呤類藥物的個(gè)體間差異大，使患者服用此藥的受益最大化和不良反應(yīng)最小化十分必要[12]。服藥前的藥物基因組學(xué)檢測(cè)可優(yōu)化藥物選擇和劑量并降低不良反應(yīng)[13]。目前檢測(cè)基因多態(tài)性的方法有等位基因特異性PCR（AS-PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）技術(shù)、焦磷酸測(cè)序、基于熒光探針的實(shí)時(shí)PCR 法等，其中AS-PCR 和實(shí)時(shí)PCR 需要特別設(shè)計(jì)引物和探針，反應(yīng)條件很難優(yōu)化，SSCP 技術(shù)受電泳溫度、膠濃度等影響容易造成漏檢，焦磷酸測(cè)序作為一種準(zhǔn)確性高的方法，邊合成邊測(cè)序，能實(shí)時(shí)獲得核苷酸序列的信息[14-16]，適合投入臨床應(yīng)用。

江蘇省臨床檢驗(yàn)中心和國(guó)家衛(wèi)計(jì)委提出的《藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南（試行）》均強(qiáng)調(diào)對(duì)每個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)在引入常規(guī)臨床實(shí)踐前應(yīng)建立性能驗(yàn)證規(guī)范[17]。鑒于目前尚無(wú)研究報(bào)道關(guān)于焦磷酸測(cè)序檢測(cè)NUDT15R139C 基因多態(tài)性的方法學(xué)評(píng)價(jià)，本研究通過(guò)考察引物和退火溫度自建焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)NUDT15R139C基因多態(tài)性，并以此為例建立了焦磷酸測(cè)序檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的性能評(píng)估方案，經(jīng)驗(yàn)證靈敏度達(dá)0.4 ng 基因組DNA，準(zhǔn)確性和重復(fù)性均符合要求，能夠投入臨床使用，為個(gè)體化使用嘌呤藥物提供臨床支持。