劉文鑫 劉亞男

(九江學(xué)院江西油茶研究中心 江西九江 332005)

油茶(Camellia oleifera)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)的常綠小喬木，是中國南方特有的木本油料樹種[1]。近年來，由于中國南方地區(qū)冬季頻發(fā)凍害、雪災(zāi)，特別是長江中下游地區(qū)等油茶主產(chǎn)區(qū)常發(fā)生低溫凍害，導(dǎo)致油茶產(chǎn)量降低，因此，對油茶開展系統(tǒng)的耐寒相關(guān)研究尤為重要。通過研究油茶在低溫下的生理反應(yīng)和調(diào)控機制，明確其響應(yīng)低溫的內(nèi)在機理，從而在低溫脅迫來臨前及時采取措施，以達到降低低溫凍害對油茶產(chǎn)生的不利影響的目的，對油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。低溫使植物的生理活動受到影響，同時植物的各種蛋白含量、酶活性也隨之發(fā)生改變，相應(yīng)抗寒基因的表達和響應(yīng)機制也發(fā)生了改變。

盡管油茶對低溫環(huán)境有較高的耐受性，但嚴重低溫造成的凍害也會導(dǎo)致樹勢減弱，引發(fā)病害，影響未來的生長和產(chǎn)量，嚴重限制了其主要產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展。在植物中，冷脅迫會引起植物在生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面的變化[2-4]。冷脅迫主要通過誘導(dǎo)光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的光抑制進而影響光合機制[5]。此外，葉綠體電子傳遞鏈的缺陷會導(dǎo)致活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生[6-7]。ROS的過量積累會導(dǎo)致膜脂過氧化反應(yīng)的增加，進而損害重要的生物大分子[8]。因此，為了消除過量的ROS，植物形成了一系列的抗氧化防御機制，包括酶抗氧化劑和非酶抗氧化劑，以保護細胞免受ROS的傷害[6-8]，主要的酶抗氧化劑包括過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等；非酶抗氧化劑包括谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(ASA)、半胱氨酸(Cys)等[9]。低溫脅迫導(dǎo)致光合碳還原電子通量的減少與SOD和APX活性的顯著增強密切相關(guān)[10]。雖然關(guān)于植物耐冷的分子機制在其他物種上已經(jīng)進行了深入的研究，但對于油茶關(guān)于低溫脅迫下分子的相關(guān)研究停留在轉(zhuǎn)錄組分析層面上[11-12]。

植物葉片的內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)能在一定程度上反映植物的生理適應(yīng)性，因此葉片結(jié)構(gòu)的差異和變化可以作為研究植物抗逆性的依據(jù)之一[13]，而在生理結(jié)構(gòu)上起主要作用的是葉片[14-15]。前人對多種植物進行低溫脅迫處理后的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對植物的生長發(fā)育會造成不利影響。因此，在油茶的抗寒性研究中葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異及生理生化特性的變化成為了研究油茶抗寒性與否的重要指標。

1低溫脅迫對油茶葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

葉片是植物進化過程中對環(huán)境變化較敏感且可塑性較大的器官。低溫脅迫后，植物通過改變外部形態(tài)來響應(yīng)脅迫環(huán)境，葉片的組織結(jié)構(gòu)與抗寒性密切相關(guān)。環(huán)境因子的臨時改變不會導(dǎo)致葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的變化，結(jié)構(gòu)是植物對環(huán)境條件長期適應(yīng)的體現(xiàn)。因此，在抗寒性研究中，葉片的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征可以作為一個評價植株抗寒性的重要指標之一[16]。植物可以通過改變?nèi)~形、葉厚及結(jié)構(gòu)等特征來適應(yīng)環(huán)境脅迫，葉片結(jié)構(gòu)中各組織的大小和所占的比例等與抗寒性密切相關(guān)[17]。前人已經(jīng)做了很多關(guān)于葉片結(jié)構(gòu)與抗寒性的相關(guān)研究[18-20]，并且分析植物葉片解剖結(jié)構(gòu)已成為評價植物抗寒性的重要方法，并應(yīng)用于不同物種抗寒性的研究[18-22]。

曾建亮等[23]通過對6個油茶品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)油茶的耐寒性主要受到葉片解剖結(jié)構(gòu)指標中上表皮厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度和氣孔密度的影響。張鑫[24]通過對不同生態(tài)區(qū)域油茶品種葉片解剖結(jié)構(gòu)進行觀察測定發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)間油茶的葉片表皮結(jié)構(gòu)差異十分顯著，組織厚度最大的鳳陽油茶更能夠忍受低溫環(huán)境。氣孔開度最小的鳳陽油茶，可能與其分布在安徽油茶的最北側(cè)有關(guān)。不同物種的油茶氣孔密度差異較大且顯著，同一物種間的無顯著差異，油茶品種不同氣孔開度不同，環(huán)境會導(dǎo)致相同品種油茶的氣孔開度差異。葉片氣孔密度越小，抗寒性越強，密度越大，抗寒性越弱。

2低溫對油茶生理特性的影響

2.1低溫對油茶光合特性的影響

光合作用是一個對非生物脅迫高度敏感的生理過程[25]。光合速率可作為研究植物光合特性的重要參數(shù)，是反映植物生長狀況、抗逆性及推斷植物生產(chǎn)力的重要指標。植物光合作用對環(huán)境條件變化非常敏感，可用來反映植物對不利環(huán)境的適應(yīng)性[26]。植物葉片的結(jié)構(gòu)對光合作用影響明顯。葉片越厚，光合能力越強，葉片越薄，光合能力越弱[27-28]。

低溫會導(dǎo)致植物吸收的光能超過能夠利用的光能，引起光抑制[29]。吳玲利等[30]人研究發(fā)現(xiàn)，“華碩”和“華鑫”油茶苗在冷馴化25d時兩個品種的Pn、Gs、Tr、Fv/Fm及qP均顯著降低，在常溫25°C恢復(fù)7d后以上指標均增加。高璐鑫等[31]研究發(fā)現(xiàn)亞低溫脅迫處理的油茶葉片PSII與PSI活性均發(fā)生抑制；亞低溫脅迫下油茶葉片光合機構(gòu)電子傳遞鏈活性顯著降低，導(dǎo)致葉片光合機構(gòu)的光合性能降低。王雨水[32]研究發(fā)現(xiàn)“雜優(yōu)閩 1”油茶幼苗在冷脅迫處理時，經(jīng)低溫鍛煉的凈光合速率降低程度小于未經(jīng)低溫鍛煉的，且常溫恢復(fù)后，前者能很快恢復(fù)，后者的沒有恢復(fù)，說明低溫鍛煉能顯著提高油茶幼苗的抗寒性，可以有效地避免冷脅迫的傷害。陳麗文等[33]研究發(fā)現(xiàn)低溫導(dǎo)致油茶的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)降低。低溫預(yù)處理后可提高油茶的抗寒性，因此光合特性的變化可以作為判斷油茶抗寒性差異的指標之一。

2.2對保護酶系統(tǒng)的影響

植物在正常生命活動中會產(chǎn)生ROS。冷脅迫影響植物的生長，使植物對能量的利用率降低，從而導(dǎo)致光合作用降低和ROS的形成。在低溫條件下，ROS的過量產(chǎn)生對植物有一定的毒性，需要經(jīng)過一系列的抗氧化系統(tǒng)進行清除。但隨著脅迫時間和程度的加劇，活性氧的積累量超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致膜脂過氧化，引起膜系統(tǒng)損傷，植物受到傷害甚至死亡[34]。在脅迫中，SOD能夠清除活性氧自由基，有利于提高植物的抗氧化能力；POD能夠分解產(chǎn)生的過氧化氫，有助于提高植物的抗氧化能力[35]。CAT能夠清除過剩的活性氧、保護細胞，從而增強植物的抗逆性。大量研究表明，這3種保護性酶與植物低溫脅迫密切相關(guān)。

低溫處理后，廣西油茶的CAT活性在20℃時最高，湖南油茶的在15℃時最高；兩種油茶中的SOD活性均在20℃時最高；廣西油茶中POD活性在15℃時最高，湖南油茶的在10 ℃時最高。大別山1號油茶隨低溫處理時間的延長，CAT和POD活性不斷降低降低[36]。遭受10～0℃范圍內(nèi)的低溫脅迫處理，油茶幼苗尚能形成低溫適應(yīng)機制；而遭受-10℃及以下低溫處理時，油茶幼苗機體代謝機能則幾乎失去平衡。經(jīng)低溫鍛煉的油茶幼苗葉片SOD、CAT和APX活性高于未經(jīng)低溫鍛煉的，說明低溫鍛煉有利于保護酶在誘導(dǎo)油茶抗寒性上發(fā)揮著重要作用[32]。

2.3對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

低溫脅迫下，植物可通過積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如，可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等來提高自身的滲透調(diào)節(jié)能力，與植物耐寒性有密切關(guān)系[37]?？扇苄蕴呛康脑黾佑兄诩毎簼舛鹊奶岣撸档图毎谋c，進而減少細胞損傷，能顯著降低低溫脅迫對植物細胞造成的損害，提高植物抗逆性[38-39]。低溫脅迫下，可溶性蛋白能夠通過增加細胞內(nèi)束縛水的含量來降低細胞受損程度。低溫脅迫下脯氨酸通過保護蛋白質(zhì)的完整性，增強相關(guān)酶的活性來抵御冷害，還可以通過減少植物體內(nèi)因脅迫產(chǎn)生的ROS，防止細胞程序性死亡，保護植物細胞免受損害，降低膜脂過氧化程度[40]。

越冬自然低溫過程中，亞林4號其他4種油茶相比有更高的可溶性蛋白含量、SOD活性、脯氨酸含量，并且可溶性糖降幅最小，表明其具有更強的抗寒性[41]。隨著亞低溫脅迫處理時間的延長，油茶“華碩”葉片中可溶性糖含量增加，淀粉含量降低，表明油茶通過促進淀粉向可溶性糖轉(zhuǎn)化，緩解了亞低溫對光合機構(gòu)的進一步傷害[31]。隨低溫脅迫時間延長葉片可溶性蛋白含量顯著上升，在低溫處理72h時，高州油茶的可溶性蛋白含量與對照相比上升了7倍；而普通油茶的與對照相比上升了4倍，普通油茶表現(xiàn)出較強的抗寒性[42]。

2.4對膜透性的影響

生物膜是細胞的基本結(jié)構(gòu)，組成了各種細胞器的膜系統(tǒng)。低溫脅迫處理后，植物細胞膜物相發(fā)生變化，膜的透性增大，電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率升高。相對電導(dǎo)率越高，細胞膜透性越大，說明細胞膜受害程度越大，導(dǎo)致抗寒性降低[43]。相對電導(dǎo)率和丙二醛含量呈顯著正相關(guān)。MDA是細胞膜膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量能反映膜受損程度和植物組織抗氧化的能力[44-45]。一般而言，MDA與植物抗性呈負相關(guān)，即MDA的含量越高，植物組織或器官受損的程度就越大，植物的抗性就越弱。

在低溫處理過程中，油茶的相對電導(dǎo)率均隨溫度的降低而上升，基本呈“S”型[46]。10℃和0℃處理4d后，大別山1號油茶葉片的MDA含量與25℃處理下相比分別增加了85.81%和32%。-10℃處理下，MDA含量增加了3倍[36]。在低溫鍛煉期間，“雜優(yōu)閩1”油茶幼苗葉片的MDA含量沒有發(fā)生明顯變化，說明低溫鍛煉沒有引起葉片的過氧化。但在冷脅迫期間，經(jīng)過和未經(jīng)過低溫鍛煉的油茶幼苗葉片的MDA含量均有所增加，但未經(jīng)低溫鍛煉的油茶幼苗MDA含量增加幅度顯著大于經(jīng)過低溫鍛煉的，說明冷脅迫對經(jīng)過低溫鍛煉的油茶幼苗的膜脂過氧化影響較小[32]，說明經(jīng)過低溫鍛煉后可減輕膜脂過氧化的影響。

3外源物質(zhì)對油茶低溫脅迫下抗性的影響

近年來，通過噴施外源調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高植物抗寒性的方法已經(jīng)得到廣泛認可，在其他物種中也有了大量研究，而油茶中的相關(guān)研究較少。與噴施清水組相比，外源甜菜堿能夠顯著緩解低溫脅迫下油茶相對電導(dǎo)率的升高，增加可溶性糖、可溶性蛋白的含量，提高SOD酶活性，降低超氧陰離子的含量，從而增強油茶對低溫的抗性[47]。向低溫脅迫的油茶噴施脫落酸(ABA)、CaCl2水溶液和抗壞血酸3種抗凍劑后發(fā)現(xiàn)，油茶的根系活力、可溶性蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)均高于對照組，油茶的MDA含量均低于對照組，說明噴施抗凍劑可以有效減少低溫脅迫對油茶的損害，提高油茶的抗凍性和適應(yīng)性，對油茶的栽培和推廣有重要意義[48]。變溫低溫脅迫處理并噴施CaCl2溶液后能夠降低油茶葉片的相對電導(dǎo)率、可溶性糖、丙二醛的增幅，提高脯氨酸、可溶性蛋白含量，提高SOD、POD活性，且低溫前噴施CaCl2溶液較低溫后噴施的效果要好[49]。

4展望

低溫脅迫是限制植物生長和發(fā)育的主要限制因素之一，特別是對于油茶這種具有重要經(jīng)濟價值的油料作物，低溫還會導(dǎo)致其產(chǎn)量降低、減少主產(chǎn)區(qū)的收益。目前關(guān)于油茶低溫脅迫的研究主要集中在比較不同品種油茶的抗性、脅迫下油茶的生理生化、光合特性及葉片結(jié)構(gòu)等變化的單一方面的研究。油茶抗性的差異受各個方面的影響，因此以后的研究要將不同方面的研究進行綜合分析，這樣才能更全面地了解油茶不同抗性的差異原因。另外，關(guān)于油茶與抗寒相關(guān)的分子生物學(xué)研究較少，特別是關(guān)于抗寒相關(guān)基因的篩選及其表達機理的研究還不夠深入，因此對低溫脅迫下油茶抗寒或耐寒相關(guān)基因的挖掘是亟需解決的問題。隨著現(xiàn)代研究手段的不斷發(fā)展以及其他物種的研究不斷完善，有必要通過現(xiàn)代分析育種技術(shù)以及其他物種的研究方法來有目的地改量高產(chǎn)但抗性差的油茶品種，為油茶產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支撐。