申 利，劉 佳，林星光

(華中科技大學同濟醫(yī)學院a.附屬梨園醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430077； b.附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030)

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科腫瘤，位居世界腫瘤的第6位，近年來其發(fā)病率逐年增加，對女性生命健康已構成嚴重威脅[1-2]。微小RNAs(miRNAs)可通過與靶基因mRNA 3′UTR區(qū)不完全互補調(diào)控靶基因的表達，進而調(diào)控癌細胞的惡性生物學行為，參與子宮內(nèi)膜癌進程[3-4]。miR-497-5p是miR-15家族成員，被證實在胃癌、卵巢癌和結直腸癌等多種腫瘤組織中低表達，被認為是一種重要的抑癌因子[5-7]。近年有研究[8]發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌組織中miR-497-5p異常低表達，且其表達水平與臨床分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移有關，但miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌細胞轉移中的作用未見報道。本研究以子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞為研究對象，探討miR-497-5p對Ishikawa細胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的影響，旨在初步了解miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和LipofectaminTM2000購于美國Invitrogen公司，胎牛血清購于美國Hyclone公司，基質(zhì)膠購于美國BD公司，Transwell小室購于美國Corning公司，聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluorid，PVDF)膜購于美國Hybond公司，青-鏈霉素購于美國Sigma公司。RIPA裂解液、結晶紫和多聚甲醇購于中國碧云天，N-cadherin、Vimentin和E-cadherin單抗體購于英國Abcam公司，貨號：6781-50、6771-100、AF0131，VEGFA、GAPDH單抗體購于美國Santa Cruz公司，貨號：MAB0294、10494-1-AP。辣根酶標記山羊抗鼠/兔IgG多抗購于北京中杉金橋公司，貨號：ZB-2301。miR-497-5p mimic、miR-497-5p inhibitor及陰性對照、VEGFA慢病毒表達載體pLV-VEGFA質(zhì)粒、VEGFA 3′-UTR的野生型(VEGFA-WT)與突變型(VEGFA-MUT)雙熒光素酶質(zhì)粒均是由上海吉瑪制藥公司設計合成。Trizol Reagent、Real time PCR試劑和總RNA提取試劑盒購于日本TaKaRa公司，反轉錄試劑盒購于美國Applied Biosystems公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購于美國Promega公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購于美國Pierce公司，ECL發(fā)光試劑盒和CO2細胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司，實時定量PCR儀購于德國Biometra公司，熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組和轉染

將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞(上海中科院細胞庫)接種于含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為CO2體積分數(shù)5%、濕度飽和和溫度37 ℃。將對數(shù)生長期的Ishikawa細胞分為：對照組(未轉染)、miR-NC組(轉染miR-497-5p mimics陰性對照)、miR-497-5p組(轉染miR-497-5p mimics)、pLV-VEGFA組(轉染pLV-VEGFA質(zhì)粒)和miR-497-5p+VEGFA組(轉染miR-497-5p mimics和pLV-VEGFA質(zhì)粒)，參照LipofectaminTM2000說明書步驟將miR-497-5p mimics陰性對照、miR-497-5p mimics和pLV-VEGFA質(zhì)粒轉染至Ishikawa細胞中。根據(jù)實驗要求進行后續(xù)檢測。

1.3 Real-time PCR檢測miR-497-5p和VEGFA mRNA的表達

收集對照組、miR-NC組和miR-497-5p組轉染48 h后的細胞，參照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取各組Ishikawa細胞的總RNA。測定總RNA濃度和純度，隨后進行反轉錄，將反轉錄產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增。其中，miR-497-5p引物(F：5′-CGCCAGC AGCACACTGTGG-3′；R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)和VEGFA引物(F：5′-CGAAGTGGTGGTCATGGATG-3′；R：5′-TT-CTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG-3′)是由上海吉凱生物公司合成。2-ΔΔCt計算miR-497-5p和VEGFA mRNA的相對表達量。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-497-5p和VEGFA的靶向關系

參照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書步驟，將VEGFA-WT與VEGFA-MUT雙熒光素酶質(zhì)粒分別與miR-497-5p mimics或miR-497-5p mimics陰性對照共轉染至Ishikawa細胞后，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。棄培養(yǎng)液后，先以磷酸緩沖液洗滌細胞，再加入細胞裂解液。裂解15 min后，離心收集上清液進行檢測。以螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值表示細胞的熒光素酶活性。

1.5 Western blot檢測VEGFA、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達

收集miR-NC組、miR-497-5p組、pLV-VEGFA組和miR-497-5p+VEGFA組轉染48 h后的細胞，RIPA裂解法液提取總蛋白。定量后，每孔加載60 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后，轉PVDF膜。5%去脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(VEGFA 1:500，N-cadherin 1:1000，Vimentin 1:1000，E-cadherin 1:1000，GAPDH 1:1000)4 ℃下孵育24 h，次日加入二抗(1:2000)常溫下孵育1.5 h?；瘜W發(fā)光顯影后，Quntity One軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白的相對表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.6 Transwell小室檢測Ishikawa細胞的侵襲和遷移

用適量的無血清培養(yǎng)基調(diào)整轉染48 h細胞濃度至2×104個·mL-1。侵襲實驗：在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μL，Transwell小室(包被基質(zhì)膠)上室中加入上述細胞懸液200 μL。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，小心擦去上室內(nèi)側細胞，分別用4%多聚甲醛、0.5%結晶紫對Transwell小室膜底部細胞進行固定和染色。以顯微鏡下隨機選取的5個視野的細胞數(shù)均值表示侵襲細胞數(shù)量。遷移實驗：Transwell小室不需要鋪基質(zhì)膠模擬人工基底膜，其余步驟和侵襲實驗一致。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 過表達miR-497-5p對Ishikawa細胞中VEGFA mRNA表達的影響

Real-time PCR檢測結果顯示，miR-497-5p組細胞中miR-497-5p的表達水平明顯高于對照組，而VEGFA mRNA的表達水平明顯低于對照組(P<0.05)；miR-NC組細胞中miR-497-5p和VEGFA mRNA的表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 對照組、miR-NC組和miR-497-5p組細胞中miR-497-5p和VEGFA mRNA的表達水平

2.2 VEGFA是miR-497-5p的潛在靶基因

TargetScan生物學信息數(shù)據(jù)庫預測結果顯示，VEGFA 3′UTR與miR-497-5p序列存在互補結合位點(表2)。檢測熒光素酶活性顯示，與VEGFA-WT共轉染的miR-497-5p組細胞的熒光素酶活性與miR-NC組比較明顯降低(P<0.05)，而同VEGFA-MUT共轉染的miR-497-5p組細胞的熒光素酶活性與miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 VEGFA 3′UTR與miR-497-5p互補結合位點

表3 miR-NC組和miR-497-5p組細胞熒光素酶活性的比較

2.3 miR-497-5p可負向VEGFA蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示，miR-497-5p組細胞VEGFA蛋白的表達水平與miR-NC組比較明顯降低，pLV-VEGFA組細胞中VEGFA蛋白表達與miR-NC組比較明顯升高(P<0.05)；然而，與pLV-VEGFA組比較，miR-497-5p+VEGFA組細胞中VEGFA蛋白表達明顯降低(P<0.05)，見圖1。

A：Western blot檢測VEGFA蛋白水平；B：各組細胞中VEGFA蛋白表達水平比較。*P<0.05與miR-NC組比較，#P<0.05與pLV-VEGFA組比較。

2.4 miR-497-5p靶向VEGFA抑制Ishikawa細胞的侵襲和遷移

Transwell小室實驗檢測結果(圖2)顯示，miR-497-5p組中的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)與miR-NC組比較均明顯減少，而pLV-VEGFA組中的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)與miR-NC組比較均明顯增多(P<0.05)；但與pLV-VEGFA組比較，miR-497-5p+VEGFA組中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)。

A：Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力；B：各組侵襲細胞數(shù)比較；C：Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力；D：各組遷移細胞數(shù)比較。*P<0.05與miR-NC組比較，#P<0.05與pLV-VEGFA組比較。

2.5 miR-497-5p靶向VEGFA抑制Ishikawa細胞的上皮間質(zhì)轉化

Western blot檢測結果顯示，miR-497-5p組細胞中上皮間質(zhì)轉化的上皮標志物E-cadherin蛋白表達與miR-NC組比較明顯升高，間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平與miR-NC組比較明顯降低(P<0.05)；同時，pLV-VEGFA組細胞中E-cadherin蛋白的表達水平明顯低于miR-NC組，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達明顯高于miR-NC組(P<0.05)。但是，miR-497-5p+VEGFA組細胞中E-cadherin蛋白的表達明顯高于pLV-VEGFA組，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達明顯低于pLV-VEGFA組(P<0.05)，見圖3。

A：Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平；B：各組細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達的比較。*P<0.05與miR-NC組比較，#P<0.05與pLV-VEGFA組比較。

3 討論

miR-497-5p是一種由MIR497HG基因編碼的miRNA，可通過多種途徑或機制調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等過程[9-10]。miR-497-5p已被證實在宮頸癌組織中呈低表達，上調(diào)其表達可通過靶向IKCa1抑制腫瘤細胞惡性增殖[11-12]。卵巢癌中miR-497表達水平降低與患者總生存率縮短關系密切，外源性miR-497可通過靶向Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1,SMURF1)抑制癌細胞遷移和侵襲[13]。提示，miR-497-5p可能抑制婦科腫瘤的發(fā)生和轉移，但在子宮內(nèi)膜癌中的作用鮮有報道。本研究通過轉染miR-497-5p mimics成功上調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中miR-497-5p表達后發(fā)現(xiàn)，Ishikawa細胞的侵襲、遷移能力以及間質(zhì)表型標記蛋白N-cadherin、Vimentin的表達水平均明顯降低，而上皮表型標志蛋白E-cadherin表達升高。EMT是賦予腫瘤細胞侵襲和遷移能力的一種過程，也是腫瘤復發(fā)和轉移的重要原因[14]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin三者是EMT發(fā)生的重要標志，在腫瘤細胞的侵襲、浸潤和轉移過程中發(fā)揮著重要作用[15-17]。本實驗結果提示，miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉化過程中發(fā)揮著重要的抑制作用。這與以往關于miR-497-5p抑制婦科腫瘤進展的研究相符。

為探究miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制，本研究采用TargetScan生物學信息學軟件和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，VEGFA是miR-497-5p的直接靶基因。VEGFA在子宮內(nèi)膜癌組織中異常高表達，與腫瘤分期、病理分級有關，而靶向抑制其表達能夠明顯抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移[18-19]。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，miR-497可通過靶向VEGFA抑制大腸癌細胞的侵襲和轉移。本研究通過轉染VEGFA慢病毒表達載體成功上調(diào)VEGFA表達后發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p對Ishikawa細胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉化的抑制作用明顯減弱。提示，miR-497-5p可通過靶向VEGFA抑制Ishikawa的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉化。

綜上所述，miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉化過程中發(fā)揮著重要的抑制作用，這可能是通過靶向下調(diào)VEGFA表達來實現(xiàn)的。