高陽(yáng)　侯非凡　熊雄　公菲菲　王金耀　邢國(guó)明　李森

摘要： 為了更加精準(zhǔn)地開展黃花菜基因組組裝和性狀定位，在課題組前期構(gòu)建的大同黃花×搖籃曲種間遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，基于大同黃花全基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，針對(duì)秋水仙堿及晝夜節(jié)律2個(gè)關(guān)鍵性狀所涉及的候選Unigene開發(fā)基因組SSR標(biāo)記，進(jìn)一步通過55個(gè)F1后代加密圖譜。結(jié)果表明，新開發(fā)的95個(gè)gSSR標(biāo)記中有46個(gè)標(biāo)記在親本及子代間具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為48.42%，有22個(gè)gSSR標(biāo)記到圖譜上，同時(shí)有12個(gè)前期未上圖的EST-SSR標(biāo)記加密到新圖譜。加密后的遺傳圖譜包含255個(gè)標(biāo)記，由9個(gè)連鎖群組成，總圖距為3 142.64 cM，平均圖距為11.88 cM，各連鎖群標(biāo)記數(shù)量為5～58個(gè)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究黃花菜秋水仙堿含量及晝夜節(jié)律的功能基因定位奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 黃花菜;gSSR;標(biāo)記開發(fā);圖譜加密

中圖分類號(hào)： Q755 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）01-0139-11

Enhancement of the interspecific genetic map density for Hemerocallis citrina and H. fulva by developing gSSR markers based on candidate genes

GAO Yang1，2， HOU Fei-fan1，2，3， XIONG Xiong1，2， GONG Fei-fei1，2， WANG Jin-yao1，2，3， XING Guo-ming1，2，3， LI Sen1，2，3

（1.College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China;2.Datong Huanghua Industry Development Research Institute，Datong 037004，China;3.Collaborative Innovation Center of Quality and Profit Improvement for the Facility Vegetables of Shanxi Province，Taigu 030801，China）

Abstract： To carry out genome assembly and character mapping of Hemerocallis citrina more accurately， genomic simple sequence repeats （SSR） markers were developed for the candidate Unigenes involved in two key characters （colchicine and circadian rhythm）， on the basis of the interspecific genetic map of DatongHuanghua×Lullaby Baby constructed by our research group previously and the whole genome and transcriptome database of DatongHuanghua. The map density was further enhanced through 55 F1 progenies. The results showed that 46 of the 95 newly developed gSSR markers were polymorphic between parents and offsprings， with a polymorphic ratio of 48.42%. 22 gSSR markers were added to the map， while 12 EST-SSR markers not mapped earlier were added to the new map. The updated genetic map contained 255 markers which was composed of nine linkage groups. The total map distance was 3 142.64 cM， and the average map distance was 11.88 cM. The number of markers in each linkage group ranged from 5 to 58. The results can make important foundation for further study on colchicine content and functional gene mapping of circadian rhythm in H.citrina.

Key words： Hemerocallis citrina;gSSR;marker development;density enhancement of the genetic linkage map

萱草屬（Hemerocallis spp.）植物是世界著名的宿根花卉之一，Li等[1]將155個(gè)萱草屬植物品種分為黃花菜（Hemerocallis citrina）等夜間開花類群和萱草（Hemerocallis fulva）等白天開花類群。黃花菜花蕾營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，又名“金針菜”，是一種重要的藥食兼用型功能蔬菜[2-4]，產(chǎn)量、品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分含量是其重要的育種目標(biāo)，黃花菜中富含多種次生代謝物，這些物質(zhì)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用[5]。黃花菜新鮮花蕾中含有次生代謝物秋水仙堿[6-7]，有報(bào)道顯示鮮食黃花菜可能產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，導(dǎo)致腹瀉等不良反應(yīng)[8]。萱草花色、花型豐富，耐干旱瘠薄，是重要的園林綠化材料，其育種主要圍繞改良觀賞性狀、提升觀賞價(jià)值來進(jìn)行[9]，萱草的觀賞性主要體現(xiàn)在花器官，而萱草屬植物花器官存在明顯的晝夜節(jié)律現(xiàn)象，該現(xiàn)象成為影響其觀賞性的重要因素。綜上，在黃花菜與萱草育種過程中，次生代謝物含量和花器官晝夜節(jié)律現(xiàn)象是2個(gè)值得重點(diǎn)關(guān)注和研究的性狀。由于萱草屬植物為宿根植物，新品種多通過自然發(fā)現(xiàn)新優(yōu)性狀種質(zhì)后無性擴(kuò)繁獲得，育種存在盲目性和隨機(jī)性。分子標(biāo)記輔助選擇育種是開展多年生植物新品種選育的有效手段，性狀選擇有針對(duì)性，育種年限可大幅縮短。其中，高密度遺傳圖譜是開展重要農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記輔助育種的重要基礎(chǔ)。

萱草屬植物遺傳背景較為復(fù)雜[10]，童期較長(zhǎng)，制作高代自交系難度較大，截至目前僅發(fā)表了2張本屬植物的遺傳圖譜。侯非凡[11]于2017年基于大同黃花（Hemerocallis citrina cv. DatongHuanghua）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用“擬測(cè)交”策略構(gòu)建了1張包含199個(gè)EST-SSR（表達(dá)序列標(biāo)簽微衛(wèi)星）分子標(biāo)記、11個(gè)連鎖群的黃花菜種內(nèi)遺傳圖譜，總圖距為2 522.34 cM，標(biāo)記間平均圖距為12.68 cM;同時(shí)構(gòu)建了1張黃花菜與萱草種間遺傳圖譜，包含222個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記、11個(gè)連鎖群，總圖距為2 485.59 cM，標(biāo)記間平均圖距為11.20 cM。2張圖譜標(biāo)記數(shù)量有限，標(biāo)記開發(fā)缺乏一定的針對(duì)性。

本研究基于課題組前期已獲得的大同黃花全基因組數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用秋水仙堿及晝夜節(jié)律所涉及的代謝通路上的候選Unigene與基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，開發(fā)與這2個(gè)性狀相關(guān)的基因組gSSR（基因組SSR）標(biāo)記，對(duì)侯非凡[11]構(gòu)建的黃花菜與萱草種間遺傳圖譜進(jìn)行加密，旨在獲得1張密度更高的黃花菜與萱草種間遺傳圖譜，為黃花菜和萱草的關(guān)鍵性狀基因定位和QTL（數(shù)量性狀座位）分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 gSSR標(biāo)記開發(fā)

1.1.1 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的候選Unigene篩選 結(jié)合課題組已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[1]（NCBI項(xiàng)目編號(hào)為PRJNA628147;登錄號(hào)為SRR11610941、SRR11610942和SRR11610943），根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)所得Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能注釋結(jié)果，篩選功能注釋于秋水仙堿（編號(hào)：ko00950）和晝夜節(jié)律（編號(hào)：ko04712）2條代謝通路中的Unigene作為候選基因。

1.1.2 基于基因組的候選Scaffold序列獲取 結(jié)合課題組大同黃花全基因組De Novo測(cè)序結(jié)果（基因組序列未發(fā)布），使用Blastn 2.2.31軟件將候選Unigene與基因組序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)軟件中E-value等參數(shù)為默認(rèn)值，篩選其中最佳的Scaffold序列。根據(jù)篩選結(jié)果，使用faSomeRecords腳本（http：//hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/）提取基因組中目標(biāo)Scaffold序列，統(tǒng)計(jì)各候選Unigene比對(duì)到基因組Scaffold上的區(qū)間位置信息，將每個(gè)比對(duì)位點(diǎn)上游、下游各擴(kuò)展3 kb序列，使用BioEdit軟件將此區(qū)間序列導(dǎo)出。

1.1.3 SSR識(shí)別及引物設(shè)計(jì) 本研究采用SSRHunter1.3軟件識(shí)別候選Scaffold序列中的SSR位點(diǎn)[12]。設(shè)置構(gòu)成重復(fù)元件的核苷酸數(shù)最多為6個(gè)，重復(fù)次數(shù)最少為5次，進(jìn)行SSR位點(diǎn)識(shí)別。SSR基序分析參考Zhang等[13]的方法。使用Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，主要參數(shù)：引物長(zhǎng)度為20～26 bp，退火溫度（Tm）為58～62 ℃，（G+C）含量為45%～55%，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為150～300 bp，引物均由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 萱草屬植物種間遺傳圖譜的加密

1.2.1 作圖親本及作圖群體 作圖群體引自課題組前期以黃花菜地方品種大同黃花作為雜交母本，萱草園藝品種搖籃曲（Hemerocallis fulva Lullaby Baby）作為雜交父本（圖1）構(gòu)建的55株F1代群體[11]，親本材料在開花時(shí)間、花色與花型上具有較大差別，且在所有的種間雜交組合中，大同黃花×搖籃曲組合的坐果率與萌發(fā)率較高，收獲了最多的F1雜交子代，因此使用大同黃花、搖籃曲作為構(gòu)建黃花菜和萱草種間遺傳圖譜的親本，親本及雜交F1代群體現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)萱草種質(zhì)資源圃內(nèi)。

1.2.2 DNA提取 采取改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[11]提取親本及55個(gè)F1子代DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整度，使用NanoDrop Spectrometer檢測(cè)DNA濃度與純度，合格樣品于-20 ℃冰箱存放備用。

1.2.3 SSR引物篩選及擴(kuò)增 本試驗(yàn)中所有g(shù)SSR引物均來自1.1.3中Primer Premier 5的設(shè)計(jì)結(jié)果，標(biāo)記名稱延續(xù)冀芳芳[14]的命名方式，以sau開頭，順次編號(hào)為sau01169、sau01170等。利用母本大同黃花和父本搖籃曲及從F1代中隨機(jī)選取的4個(gè)子代共6個(gè)樣品來篩選多態(tài)性SSR引物。PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)、SSR標(biāo)記分離檢測(cè)、讀帶數(shù)據(jù)處理等參照侯非凡[11]的方法。

1.2.4 圖譜加密 利用Joinmap 4.1軟件對(duì)新開發(fā)的gSSR標(biāo)記及原始圖譜構(gòu)建時(shí)所使用的標(biāo)記進(jìn)行分析和作圖，從而加密原始種間遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選Unigene的篩選

秋水仙堿屬于異喹啉類生物堿，共有20個(gè)Unigene注釋到秋水仙堿生物合成所在的異喹啉類生物堿代謝通路中，其在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的通路編號(hào)為ko00950。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基因功能注釋結(jié)果，20個(gè)Unigene所注釋到的酶均為秋水仙堿合成通路中所涉及的關(guān)鍵酶（表1）。

基于植物晝夜節(jié)律代謝通路圖（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為ko04712），其中心振蕩環(huán)上共有6個(gè)基因，分別為CCA1、LHY、TOC1、APRR1、ZTL、GI。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基因功能注釋結(jié)果，共18個(gè)Unigene注釋為這6個(gè)基因。由于本試驗(yàn)基于擬南芥LHY基因的CDS（編碼序列）對(duì)Unigene庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，未直接注釋到LHY基因的c56440.graph_c0與擬南芥中的LHY基因序列相似度較高，所以將此Unigene也加入到候選Unigene范圍（表1）。

綜上，共有39個(gè)Unigene成為本試驗(yàn)候選Unigene。

2.2 候選Scaffold序列比對(duì)結(jié)果

39條候選Unigene的BLAST報(bào)告篩選結(jié)果表明，與秋水仙堿合成通路相關(guān)的20條Unigene中共有9條比對(duì)到了基因組序列上，涉及16條Scaffold序列;與植物晝夜節(jié)律代謝通路的中心振蕩環(huán)相關(guān)的19條Unigene中共有11條Unigene比對(duì)到了基因組序列上，涉及35條Scaffold序列（表2）。綜上，共得到51條候選Scaffold序列。其中與晝夜節(jié)律相關(guān)的c58223.graph_c0比對(duì)到的Scaffold序列最多，為8條。c56932.graph_c0和mergeScaf2663序列相似性最高，比對(duì)分?jǐn)?shù)為3 781分，c56403.graph_c0的比對(duì)分?jǐn)?shù)最低。

根據(jù)各候選Unigene比對(duì)到基因組Scaffold上的區(qū)間位置信息，將每個(gè)位點(diǎn)上下游各擴(kuò)展3 kb序列，即區(qū)間共擴(kuò)展6 kb序列，候選序列在各Scaffold自5′端到3′端的位置信息如表2所示。

2.3 候選Scaffold序列中SSR基序的鑒定

SSRHunter 1.3檢測(cè)結(jié)果表明，有36條Scaffold檢測(cè)到了SSR位點(diǎn)，其中與秋水仙堿相關(guān)的Scaffold為11條，與晝夜節(jié)律相關(guān)的Scaffold為25條。在上述36條Scaffold序列中共有95個(gè)gSSR位點(diǎn)，其中mergeScaf17449包含最多的gSSR（12個(gè)），其次是mergeScaf1943（8個(gè)），有9條Scaffold只能檢測(cè)到1個(gè)gSSR位點(diǎn)（圖2）。

此外，在檢測(cè)到的95個(gè)gSSR位點(diǎn)中，基序類型為二核苷酸重復(fù)（Di）的有67個(gè)，占gSSR位點(diǎn)總數(shù)的70.53%;基序類型為三核苷酸重復(fù)（Tri）的共有25個(gè)，占比26.32%（圖3A）;基序類型為四核苷酸重復(fù)（Tetra）、五核苷酸重復(fù)（Penta）、六核苷酸重復(fù)（Hexa）的gSSR位點(diǎn)數(shù)很少。在36條Scaffold中統(tǒng)計(jì)了每種SSR基序重復(fù)元件數(shù)量的分布，在二核苷酸重復(fù)類型中，含有AT & TA、AG & GA單元的二核苷酸SSR數(shù)量要明顯多于其他類型的二核苷酸重復(fù);在其余核苷酸重復(fù)類型中，并未出現(xiàn)以TG、CG或GC作為重復(fù)單元的基序（圖3B）。

2.4 gSSR引物篩選及多態(tài)性分析

對(duì)檢測(cè)到的95個(gè)gSSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物并進(jìn)行多態(tài)性篩選，部分結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，共有69對(duì)gSSR引物能夠擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的條帶，占引物總數(shù)的72.63%;共有46對(duì)gSSR引物在親本及子代間具有多態(tài)性，多態(tài)性gSSR引物占引物總數(shù)的48.42%。

使用多態(tài)性引物在群體中進(jìn)行擴(kuò)增，共有29對(duì)gSSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶可以判讀，經(jīng)過卡方（χ2）測(cè)驗(yàn)檢測(cè)這29對(duì)多態(tài)性SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物在子代中的分離情況，其中22對(duì)引物所得產(chǎn)物在子代中分離情況符合孟德爾分離比例（1∶1，1∶2∶1，1∶1∶1∶1），7對(duì)引物所得產(chǎn)物存在不同程度偏分離現(xiàn)象（P<0.05），偏分離標(biāo)記占多態(tài)性引物的比例為24.13%。29對(duì)引物具體分離情況見表3。

2.5 種間遺傳圖譜加密

利用Joinmap 4.1軟件加密黃花菜種間遺傳圖譜，共有291個(gè)SSR標(biāo)記參與運(yùn)算，其中包括課題組前期開發(fā)的262個(gè)EST-SSR標(biāo)記以及29個(gè)新開發(fā)的gSSR標(biāo)記。在LOD值為3.0時(shí)劃分為9個(gè)連鎖群。制圖過程中有13個(gè)標(biāo)記（12個(gè)EST-SSR標(biāo)記和1個(gè)gSSR標(biāo)記）由于對(duì)連鎖群結(jié)構(gòu)和標(biāo)記分布均勻性產(chǎn)生較大影響而舍去，有23個(gè)標(biāo)記（17個(gè)EST-SSR標(biāo)記和6個(gè)gSSR標(biāo)記）由于形成單標(biāo)記或者雙標(biāo)記連鎖群而未能進(jìn)入最終的圖譜。連鎖圖譜總圖距為3 142.64 cM，圖譜長(zhǎng)度較原始種間圖譜增加了657.05 cM，連鎖群（LG）長(zhǎng)度為28.26～879.50 cM（表4）。

圖譜共有255個(gè)標(biāo)記，包括233個(gè)EST-SSR標(biāo)記以及22個(gè)gSSR標(biāo)記。相鄰標(biāo)記中最大間距大于80 cM的間距共有4個(gè)，分別位于LG1、LG2、LG3和LG8，最大的間距為150.28 cM，這個(gè)間距位于LG2的sau555、sau481和sau825之間（圖5）。圖譜平均圖距為11.88 cM。加密后的黃花菜與萱草種間遺傳圖譜中SSR標(biāo)記在9個(gè)連鎖群上的分布是不均勻的，各連鎖群標(biāo)記數(shù)量為5～58個(gè)，標(biāo)記數(shù)量最多的連鎖群為L(zhǎng)G1，共有58個(gè)標(biāo)記;LG9的標(biāo)記數(shù)量最少，為5個(gè)（表4）。共有22個(gè)gSSR標(biāo)記被加密到種間遺傳圖譜上，其中7個(gè)gSSR標(biāo)記來源于秋水仙堿代謝通路相關(guān)候選Scaffold，15個(gè)標(biāo)記來源于晝夜節(jié)律代謝通路候選Scaffold，這些標(biāo)記位于LG1、LG2、LG3、LG4和LG7上（圖5）。其中，位于LG1的sau01228和sau01182在遺傳圖譜上位于同一遺傳距離，2個(gè)標(biāo)記是由不同性狀的候選基因開發(fā)而來的，其對(duì)應(yīng)的Scaffold序列是不同的，2個(gè)標(biāo)記在群體中的基因分型也是不同的，sau01228為nn×np分型，sau01182為ef×eg分型，是不一樣的2個(gè)標(biāo)記。類似的情況也出現(xiàn)在LG3上的sau01263、sau01260和sau01254這3個(gè)標(biāo)記，它們位于不同的Scaffold，其在群體中的基因分型也是不同的，sau01263為nn×np分型，sau01260為ef×eg分型，sau01254為nn×np分型。

2.6 加密后圖譜的優(yōu)化整合

將加密后的圖譜與課題組前期構(gòu)建的框架種間遺傳圖譜[11]進(jìn)行比較，結(jié)果表明，加密前黃花菜與萱草種間遺傳圖譜具有11個(gè)連鎖群（HFLG1～HFLG11），新標(biāo)記具有明顯的連鎖群整合效果，加密后為9個(gè)連鎖群（LG1～LG9），其中，LG1上由于標(biāo)記sau01229與sau01183的加入使得之前的HFLG2與HFLG10這2個(gè)連鎖群整合到了一起，HFLG10整體插入到了HFLG2的sau722與sau920之間，sau01179、sau01228、sau01182、sau01203和sau01214這5個(gè)標(biāo)記也均勻地插入到了LG1上，并且由于這些標(biāo)記的加入使得之前沒有上圖的單標(biāo)記sau275與3標(biāo)記sau677、sau215、sau979也加入到了LG1頂端，遺傳距離由HFLG2的401.8 cM和HFLG10的44.4 cM合并增加到了879.5 cM（圖6）。LG2中共增加了6個(gè)標(biāo)記，分別為sau01174、sau01221、sau01173、sau01172、sau01201、sau01202，這些標(biāo)記都加入到了LG2的偏底端位置，原HFLG1上的sau272因加密后致使LG2長(zhǎng)度發(fā)生較大變化而舍棄。LG3上新加入了sau01263、sau01260、sau01254、sau01218、sau01226、sau01225這6個(gè)標(biāo)記，連鎖群長(zhǎng)度增加了59.8 cM，另外由于新標(biāo)記的加入使得LG3上部sau779～sau1017片段發(fā)生了倒位，原本處于HFLG3底端的sau937移動(dòng)到了LG3頂端。LG4由于單標(biāo)記sau01233的加入使之前HFLG5和HFLG8合并為1個(gè)連鎖群，長(zhǎng)度由HFLG5的141.1 cM和HFLG8的95.4 cM增加為253.8 cM。對(duì)LG5對(duì)應(yīng)的HFLG4上的原標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整后，之前未上圖的sau311、sau310、sau48、sau863、sau987、sau433、sau562、sau338這8個(gè)標(biāo)記也加入到了LG5上。LG7加入了2個(gè)新標(biāo)記sau01186以及sau01196。其余連鎖群均與之前保持一致，并未發(fā)生改變（圖6）。

3 討論

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）由于重復(fù)性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)已經(jīng)成為基因定位和遺傳多樣性研究的首選標(biāo)記[15]，SSR標(biāo)記廣泛應(yīng)用于品種鑒定[1]、圖位克隆[16]、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[13]、遺傳多樣性研究[17]、遺傳圖譜構(gòu)建[18]等。目前，SSR標(biāo)記的類型可以大致分為2種，一種是通過RNA-seq開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記，EST是基因表達(dá)序列，通過這種方式開發(fā)的標(biāo)記主要對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，所以在物種間具有很好的通用性，并且使用這些標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜相當(dāng)于定位功能已知的基因[19]。結(jié)合關(guān)聯(lián)分析，如果某性狀與圖譜上的EST-SSR關(guān)聯(lián)，那么這個(gè)標(biāo)記有極大的可能與控制該性狀的基因有關(guān)[20]。另外一種是通過基因組開發(fā)的gSSR標(biāo)記，該標(biāo)記是較為理想的構(gòu)建圖譜的標(biāo)記，大多數(shù)存在于基因組的非編碼區(qū)[21]。

基于此思路，本研究從秋水仙堿和晝夜節(jié)律相關(guān)代謝通路（ko00950、ko04712）上的候選Unigene入手，以期在候選EST-SSR附近開發(fā)gSSR標(biāo)記來加密該區(qū)段。值得一提的是，在篩選晝夜節(jié)律相關(guān)Unigene時(shí)，c56440.graph_c0表現(xiàn)出與擬南芥中LHY基因極高的序列相似性，基于序列決定生物學(xué)功能的考慮，認(rèn)為該Unigene極可能在本物種中存在LHY相關(guān)基因功能，故亦納入候選Unigene篩選范疇。

有學(xué)者的研究結(jié)果表明，使用單一類型標(biāo)記構(gòu)圖會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記分布不均勻，標(biāo)記類型的不同會(huì)影響標(biāo)記在連鎖群上的分布[21-22]。因此，本研究綜合使用新開發(fā)的gSSR和前期的EST-SSR 2種標(biāo)記來進(jìn)行圖譜構(gòu)建。從結(jié)果來看，標(biāo)記仍然是分布不均勻的，可能原因與標(biāo)記數(shù)量不足以及標(biāo)記自身的非隨機(jī)分布有關(guān)，此次圖譜加密過程僅使用了部分基因組序列來開發(fā)gSSR標(biāo)記，在之后的研究中，基于全基因組SSR標(biāo)記開發(fā)進(jìn)行圖譜加密應(yīng)該是一個(gè)有效的解決方案。此外，由于EST-SSR來自比較保守的編碼區(qū)，很多研究結(jié)果表明gSSR的多態(tài)性要高于EST-SSR[15，23]，本研究中新開發(fā)的gSSR標(biāo)記多態(tài)性比例為48.42%，高于侯非凡[11]使用的EST-SSR標(biāo)記（22.49%）。

理論上，分子連鎖群的數(shù)目應(yīng)該與染色體數(shù)目相等[24]，加密后其連鎖群數(shù)目由11個(gè)整合為9個(gè)，這可能是由于萱草屬植物具有較為龐大的基因組（3.61 Gb），而圖5中標(biāo)記只有255個(gè)，難以覆蓋整個(gè)基因組，在此基礎(chǔ)上開發(fā)新標(biāo)記、擴(kuò)大作圖群體，是填補(bǔ)圖譜Gap的有效方法，這也是本研究接下來的努力方向，以期為黃花菜和萱草分子標(biāo)記輔助育種、關(guān)鍵性狀基因定位及數(shù)量性狀座位（QTL）分析奠定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-06-26

基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)青年拔尖創(chuàng)新人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（BJRC20-1601）;山西省農(nóng)業(yè)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（20170-3D211001-04-05、201903D211011-01）;山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2019L0375）

作者簡(jiǎn)介：高 陽(yáng)（1995-），男，山西朔州人，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳改良方面的研究。（E-mail）sau_gaoyang@163.com

通訊作者：李 森，（E-mail）saulisen@163.com