胡楊兮 油紅敏 任昌振 張艷達 梁春

1 概述

斑馬魚(zebrafish)又名藍條魚、花條魚、印度魚，屬輻鰭魚綱鯉形目鯉科，多生活于中亞和南亞的熱帶地區(qū)。斑馬魚成魚身體呈紡錘形，長度為3～5 cm，頭尖吻短，因體表有銀白或金黃與藍色相間排列的花紋，形似斑馬而命名。斑馬魚作為一種新型的模式動物，廣泛應用于組織發(fā)育[1]、心血管系統(tǒng)疾病[2]以及腫瘤[3]等領域的研究。相比其他經(jīng)典的模型動物，斑馬魚有獨特優(yōu)勢：(1)性成熟周期短，產(chǎn)卵量大。斑馬魚性成熟約3個月，母魚每周產(chǎn)卵達200枚。(2)可視性好。斑馬魚胚胎及幼魚通體透明，便于活體觀察心臟、血管的實時狀態(tài)并進行實驗操作。(3)轉基因魚系豐富?？蒲腥藛T通過基因編輯技術構建了多種心血管系統(tǒng)組織特異性的熒光魚系，如Tg(fli1∶EGFP) 轉基因魚系用綠色熒光標記血管內皮細胞、Tg(myl7∶EGFP)魚系用綠色熒光標記心肌細胞、Tg(gata1∶mcherry)魚系用紅色熒光標記紅細胞等，極大提高了斑馬魚在心血管系統(tǒng)發(fā)育和疾病研究中的地位。心血管病治療藥物的研發(fā)需要進行短周期、高通量的篩選。許多藥物需要在體內轉化為有效的活性形式才能發(fā)揮作用，經(jīng)典的小鼠等動物模型和細胞模型不能滿足篩選研究的需要。2008年Yu等[4]利用斑馬魚模型篩選出激活素受體樣激酶(Alk)的第一個小分子拮抗劑多索嗎啡(Dorsomorphin),其可以作用于血管內皮生長因子(VEGF)受體，從而阻斷血管生成[5]。轉基因斑馬魚體量小、繁殖快及可視性等特點，使其成為在體藥物篩選研究的優(yōu)選[6]。

2 斑馬魚與心血管病治療藥物篩選研究

2.1 血管新生調節(jié)藥物的篩選

斑馬魚模型在血管新生調節(jié)藥物的篩選研究中廣泛應用，在篩選有效藥物的同時也發(fā)現(xiàn)眾多精準調控斑馬魚血管發(fā)生的小分子及其相應受體介導的信號通路。較常用的是以熒光蛋白標記血管內皮細胞的轉基因魚系Tg(fli1∶EGFP)和Tg(fli1∶nEGFP)等。有研究者利用藥物干擾斑馬魚血管新生過程，再對促進血管損傷修復的藥物進行篩選，如利用酪氨酸酶抑制劑誘導幼魚血管損傷后，用黃芪多糖處理可以顯著修復損傷[7]。利用Tg(fli1∶EGFP)、Tg(fli1∶nEGFP)魚系對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)進行研究，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮[8]和降香提取物[9]通過上調VEGF受體表達，促進幼魚血管新生和節(jié)間血管損傷修復。Liu等[10]對用地黃提取物處理Tg(fli1∶EGFP)胚胎的腸下血管(SIV)新生長度和出芽數(shù)量進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)地黃提取物中的二氯甲烷、咖啡酸等物質也具有促進血管新生的作用。知母皂苷BⅡ具有促血管新生和修復受損血管的作用，其機制可能是使VEGF受體和促炎性細胞因子(如白細胞介素-6)的表達上調[11]。

利用轉基因斑馬魚可以對成分復雜的中藥方劑進行快速篩選研究。Tse等[12]發(fā)現(xiàn)地黃與黃芪配伍可通過上調VEGF-A及類激酶插入?yún)^(qū)受體(Kdrl)的表達，促進幼魚節(jié)間血管過度生長。麝香保心丸有效成份之一的肉桂醛可部分改善由VEGF受體抑制劑瓦他拉尼二鹽酸鹽誘導的斑馬魚幼魚節(jié)間血管的缺失[13]。

2.2 調脂藥物的篩選

斑馬魚的脂質代謝過程與哺乳動物相似，高膽固醇飲食可誘導斑馬魚的脂蛋白氧化、血管內脂質堆積、免疫細胞遷移等早期動脈粥樣硬化征象。利用斑馬魚構建脂代謝紊亂的疾病模型可用于高脂血癥、動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等的機制研究和藥物篩選。Han等[14]報道小檗胺可以顯著降低高膽固醇飲食斑馬魚的血漿脂肪含量，伊折麥布則可顯著改善脂質在斑馬魚血管內的堆積[15]。Littleton等[16]利用脂代謝紊亂斑馬魚幼魚模型發(fā)現(xiàn)山楂葉和山楂花可明顯降低斑馬魚血漿低密度脂蛋白水平，抑制膽固醇的吸收，提高心輸出量。用枇杷葉提取物處理脂代謝紊亂斑馬魚模型后發(fā)現(xiàn)斑馬魚血漿中總膽固醇和三酰甘油水平降低，提示枇杷葉有抗動脈粥樣硬化作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃和月桂的水提取物也可抑制斑馬魚膽固醇酯和低密度脂蛋白活性[18]，進而抑制動脈粥樣硬化和糖尿病的進展。除了檢測血脂，還可以通過其他方法探究藥物對斑馬魚脂代謝的影響。如制首烏及大黃素還可顯著降低斑馬魚的體質量、體長，并減輕肝臟中的脂質沉積，其機制可能是通過上調磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸激酶2(AKT2)、一磷酸腺苷激活的蛋白激酶α(AMPKα)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、肉堿棕櫚酰轉移酶1a(CPT-1a)和?；o酶A氧化酶1(ACOX1)的表達，從而減少肝臟脂質合成[19]。白藜蘆醇雖然未明顯改變斑馬魚血漿中脂質含量和體質量、體長，但能明顯改善肝臟脂肪浸潤，提示其可能存在長效調脂作用[20]。

2.3 抗炎藥物的篩選

許多心血管病與炎性反應密切相關，如動脈粥樣硬化、血管炎以及結締組織病的心血管系統(tǒng)病變等。目前已構建大量特異熒光標記炎性細胞的轉基因魚系模型[21]，如用綠色熒光標記中性粒細胞的Tg(lyz∶EGFP) 轉基因魚系、用紅色熒光標記巨噬細胞的Tg(coro1a∶mCherry)魚系等，可實時、動態(tài)觀察在心肌細胞或血管內皮細胞受到損傷后發(fā)生炎性反應，或使用抗炎藥物后對特定炎性細胞的分化、分布等方面的影響。Luo等[22]對熒光標記中性粒細胞和血管內皮細胞的Tg(lyz∶EGFP;flk1∶mCherry)轉基因魚系喂養(yǎng)高膽固醇飲食，證實高膽固醇飲食誘導斑馬魚的血管內皮炎性反應早于血管內中性粒細胞的募集和脂質沉積，且在動脈粥樣硬化的初始階段中性粒細胞募集早于脂質沉積。另外，用脂多糖處理斑馬魚胚胎可構建急性炎性反應斑馬魚模型。Fan等[23]利用綠色熒光標記中性粒細胞、紅色熒光標記巨噬細胞的Tg(coro1a∶mCherry;lyz∶dsRed) 轉基因魚系構建急性炎性反應模型，并對斑馬魚尾鰭進行部分切除，發(fā)現(xiàn)毛竹黃酮處理的斑馬魚模型的切口處中性粒細胞和巨噬細胞的募集顯著減少。研究發(fā)現(xiàn)，利用特異熒光標記淋巴中性粒細胞和心肌細胞的轉基因魚系，在反復發(fā)生冷凍損傷后心肌恢復能力降低，這與中性粒細胞的募集增強和再生心肌細胞早期增殖和去分化減少有關[24]。組胺在多種炎性反應中大量釋放，有研究發(fā)現(xiàn)用組胺H1受體拮抗劑處理用特異熒光標記心肌細胞的Tg(cmlc2∶mCherry)轉基因斑馬魚胚胎，可引起胚胎心臟早期發(fā)育異常[25]。還有研究發(fā)現(xiàn)干巴菌主要成分之一的菌絲體鋅多糖-2(MZPS-2)可清除斑馬魚模型的自由基，減少由炎性反應引起的活性氧的生成，并抑制中性粒細胞向損傷部位的聚集。

2.4 抗心肌損傷藥物的篩選

Li等[26]將用特異熒光標記血管內皮細胞的Tg(kdrl∶mCherry)和用特異熒光標記心肌細胞的Tg(myl7∶GFP)轉基因斑馬魚暴露于擬除蟲菊酯殺蟲劑溴氰菊酯，聯(lián)用褪黑素和丹參酮ⅡA磺酸鈉可以顯著減輕溴氰菊酯引起的心血管毒性和睡眠喚醒，同時相關基因的表達恢復到正常水平。酒精可引起斑馬魚胚胎體長縮短和心臟水腫，而白藜蘆醇對酒精引起的斑馬魚胚胎心臟有保護作用[27]。阿霉素對斑馬魚心臟收縮力和心率有明顯的負性作用，可導致斑馬魚胚胎心臟出血，心搏減弱甚至停跳；丹參的天然產(chǎn)物二氫丹參酮可減輕阿霉素對斑馬魚幼魚的心臟毒性，提高心臟收縮功能、促進尾靜脈血流[28]。

2.5 其他心血管病治療藥物的篩選

在抗血栓藥物篩選方面，利用花生四烯酸可在綠色熒光標記血紅蛋白的Tg(LCR∶EGFP)斑馬魚上建立血栓模型。Qi等[29]發(fā)現(xiàn)丹紅注射液的主要成分(丹參、紅花、迷迭香酸和對香豆酸等)均有抗血栓形成作用。Sheng等[30]利用苯肼在綠色熒光標記成熟血小板的Tg(CD41∶EGFP)和Tg(LCR∶EGFP)轉基因斑馬魚上建立血栓模型，發(fā)現(xiàn)通脈的主要化學成分——隱丹參酮具有顯著的抗血栓作用。Zuo等[31]利用苯肼誘導的斑馬魚血栓模型，發(fā)現(xiàn)丹參可直接與凝血途徑調控靶點中的凝血酶、凝血因子Ⅹa和環(huán)氧合酶-1發(fā)生反應，而川芎可以特定的比例與丹參配伍，發(fā)揮協(xié)同抗血栓作用。在抗心律失常藥物篩選方面，Liu等[32]利用特非那定在Tg(cmlc2∶GFP)斑馬魚胚胎上建立心律失常模型，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒中提取的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、黨參炔苷和黨參提取物Lobetyolinin等化合物具有抗心律失常作用。

多種藥物可通過誘導心肌損傷構建心力衰竭斑馬魚模型。異丙腎上腺素誘導的慢性心力衰竭模型中斑馬魚出現(xiàn)心率降低，心室腔面積增大，射血分數(shù)降低和心包水腫[33]。利用特定濃度的阿奇霉素處理斑馬魚胚胎3 d后，胚胎可出現(xiàn)心率降低和心輸出量減少[34]，而雷公藤紅素處理的斑馬魚胚胎會發(fā)生心臟畸形及出血[35]。Huang等[36]發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸可使幼魚心臟肌節(jié)聚集、肌纖維破壞和內皮細胞數(shù)量減少，從而使幼魚出現(xiàn)心率減低、循環(huán)減慢或停止、血管淤血水腫等。

3 小結

斑馬魚模型極大地推動了心血管病藥物的高通量篩選研究。利用斑馬魚模型進行藥物篩選研究的規(guī)模大，效率高，成本低，有巨大的應用潛力。目前基于斑馬魚模型建立的心血管病治療藥物篩選平臺的應用多集中于血管新生、脂代謝、心臟毒性等方面，而心律失常、心肌代謝病、高血壓等疾病的斑馬魚模型和治療藥物篩選平臺還有待完善。另外，現(xiàn)階段利用斑馬魚模型進行藥物篩選時一般是將藥物溶于培養(yǎng)水，無法精確定量個體攝入量和血藥濃度，可能導致實驗結果偏倚。