阿燕·西合斯 羅健 邵明明 張玉璽 張?jiān)疵?王凌鵬

淋巴細(xì)胞連接蛋白(LNK)是人類高血壓的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[1]。該蛋白上有多個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，可作為受體被磷酸化，在不同細(xì)胞信號(hào)通路如Janus激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號(hào)通路中發(fā)揮作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT信號(hào)通路激活能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的局部合成，參與高血壓的發(fā)生發(fā)展[3-4]。本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，高血壓患者體內(nèi)LNK與炎性細(xì)胞因子的表達(dá)存在相關(guān)性，LNK可能通過負(fù)性調(diào)控炎性細(xì)胞因子分泌，參與高血壓的發(fā)生發(fā)展。本研究建立高血壓血管平滑肌細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討LNK介導(dǎo)的JAK/STAT信號(hào)通路在高血壓血管重構(gòu)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞購(gòu)自凱基生物。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代。培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁融合達(dá)90%時(shí)，加入10 μmol/L AngⅡ，繼續(xù)干預(yù)24 h，構(gòu)建高血壓細(xì)胞模型。

1.3 pIRES2-LNK過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

將VSMC分為4組：對(duì)照組，正常培養(yǎng)VSMC 72 h；AngⅡ組，正常培養(yǎng)VSMC 48 h后，加入AngⅡ干預(yù)24 h；AngⅡ+空載組，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP空載質(zhì)粒72 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束前24 h加入AngⅡ干預(yù)VSMC細(xì)胞24 h；AngⅡ+LNK組，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-SH2B3重組載體72 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束前24 h加入AngⅡ干預(yù)VSMC 24 h。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平

取VSMC，制備成5×104/mL單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中，100 μL/孔，細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，按照1.4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組并干預(yù)。干預(yù)完成后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 10%CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值，即為所需記錄的光密度(OD)值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率

將干預(yù)后的各組VSMC制成單細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD，4 ℃避光放置5 min后用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析，檢測(cè)并記錄細(xì)胞周期、凋亡率。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平

收集干預(yù)后的各組VSMC，以β-actin為內(nèi)參，使用Trizol提取總RNA，核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定RNA濃度及純度。采用全式金生物公司的TransZol Up和cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為25 ℃ 10 min，85 ℃ 5 s，引物見表1。cDNA使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒QuantiNava SYBR Green Kit進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)LNK、STAT3、JAK2的mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，用2-△△Ct法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

收集干預(yù)后的各組VSMC，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉的封閉1 h，LNK、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD方法進(jìn)行多重比較，方差不齊時(shí)采用Tamhane方法進(jìn)行多重比較。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，使數(shù)據(jù)正態(tài)化，再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行上述單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VSMC增殖水平比較

AngⅡ組(1.482±0.104)和AngⅡ+空載組(1.480±0.092)VSMC增殖水平明顯高于對(duì)照組(1.244±0.046)，而AngⅡ+LNK組(1.263±0.053)中VSMC增殖水平明顯低于AngⅡ組和AngⅡ+空載組(P均<0.05)。

2.2 各組VSMC凋亡率比較

AngⅡ組[(4.503±0.223)%]和AngⅡ組+空載組[(3.837±0.546)%]VSMC凋亡率明顯低于對(duì)照組[(5.723±0.110)%]，而AngⅡ+LNK組[(5.210±0.053)%]中VSMC細(xì)胞凋亡率明顯高于AngⅡ組和AngⅡ+空載組(P均<0.05)。見圖1。

注:A為對(duì)照組；B為AngⅡ組；C為AngⅡ+空載組；D為AngⅡ+LNK組

2.3 各組VSMC細(xì)胞周期比較

與對(duì)照組比較，AngⅡ組和AngⅡ+空載組VSMC處于細(xì)胞休眠期(G0期)/DNA合成前期(G1期)的比例減少，處于DNA合成期(S期)、 DNA合成后期(G2期)/分裂期(M期)的比例增加(P均<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+空載組VSMC處于S期的比例減少，處于G2/M期的比例增加，AngⅡ+LNK組VSMC處于G0/G1期的比例增加，處于S期的比例減少(P均<0.05)。與AngⅡ+空載組比較，AngⅡ+LNK組VSMC處于G0/G1期的比例增加，處于S期、G2/M期的比例減少(P均<0.05)。 見表2、圖2。

表2 各組VSMC細(xì)胞周期比較/%

注：A為對(duì)照組；B為AngⅡ組；C為AngⅡ+空載組；D為AngⅡ+LNK組

2.4 各組SH2B3、STAT3、JAK2的mRNA表達(dá)水平比較

AngⅡ組、AngⅡ+空載組VSMC中編碼LNK的SH2B3基因的mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，AngⅡ+空載組中SH2B3的mRNA表達(dá)水平明顯低于AngⅡ組, AngⅡ+LNK組中SH2B3的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組、AngⅡ組和AngⅡ+空載組(P均<0.05)。AngⅡ組、AngⅡ+空載組中STAT3及JAK2的mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，AngⅡ+LNK組中STAT3及JAK2的mRNA表達(dá)水平均明顯低于AngⅡ組和AngⅡ+空載組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組SH2B3、STAT3、JAK2的mRNA表達(dá)水平比較

2.5 各組SH2B3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2的蛋白表達(dá)水平比較

AngⅡ組和AngⅡ+空載組的SH2B3蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，AngⅡ+LNK組的SH2B3蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組、AngⅡ組和AngⅡ+空載組(P均<0.05)。AngⅡ組和AngⅡ+空載組p-STAT3、p-JAK2的蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，AngⅡ+LNK組p-STAT3、p-JAK2的蛋白表達(dá)水平均明顯低于AngⅡ組和AngⅡ+空載組(P均<0.05)，見表4、圖3。

表4 各組SH2B3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2的蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組VSMC細(xì)胞中SH2B3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2的蛋白表達(dá)情況

3 討論

高血壓的主要特點(diǎn)是血壓升高和由其導(dǎo)致的血管重構(gòu)[5-6]。研究血管重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可能有助于控制高血壓。人體內(nèi)LNK由12號(hào)染色體上的SH2B3基因編碼，參與細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控[7]，可以介導(dǎo)各種炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、γ干擾素(INF-γ)等的表達(dá)。研究表明LNK與高血壓具有相關(guān)性[8-10]。

本研究結(jié)果顯示，高血壓模型組即AngⅡ+空載組VSMC主要處于S期、G2/M期，且凋亡率低，提示VSMC處于增殖期，AngⅡ+LNK組VSMC主要處于G0/G1期，凋亡率增加，提示VSMC處于休止期，細(xì)胞增殖、血管重構(gòu)受抑，這提示LNK可能通過抑制高血壓血管平滑肌細(xì)胞的增殖，減少血管重構(gòu)，從而影響高血壓的發(fā)生發(fā)展。

JAK/STAT是LNK的經(jīng)典信號(hào)通路，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞免疫等過程[11-14]。Satou等[15]研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路在AngⅡ依賴性高血壓的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。JAK/STAT信號(hào)通路在最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是造血和免疫細(xì)胞中干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，JAK激酶和STAT蛋白特異性表達(dá)于血管壁中，并轉(zhuǎn)導(dǎo)各種受體家族的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，參與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子、生長(zhǎng)因子和血管活性肽的表達(dá)[16]。JAK可直接與1型血管緊張素(AT1)受體結(jié)合[17]，增強(qiáng)其在血管中的磷酸化。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ+LNK組中STAT3、JAK2的mRNA表達(dá)水平和p-STAT3、p-JAK2的蛋白表達(dá)水平均明顯低于AngⅡ組和AngⅡ+空載組，提示LNK可能通過JAK/STAT信號(hào)通路參與高血壓的血管重構(gòu)。JAK2、STAT3可加劇內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，研究表明AngⅡ能引起心肌細(xì)胞 STAT3的雙相激活，JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞重構(gòu)[14]。JAK2/STAT3 信號(hào)通路可以改善妊娠高血壓大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能，抑制大鼠血管重構(gòu)[18]。本研究建立高血壓模型，發(fā)現(xiàn)LNK蛋白在高血壓中處于低表達(dá)狀態(tài)，且發(fā)現(xiàn)LNK蛋白通過負(fù)性調(diào)節(jié)JAK-STAT信號(hào)通路抑制了高血壓的血管重構(gòu)。