李天然（綜述） 盧光明（審校）

（1.解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心放射診斷科，北京 100048；2.解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射診斷科，江蘇 南京 21000）

基于自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的生物治療是多種疾病最有潛力的治療方法[1-2]。BMSCs移植后，在體BMSCs轉(zhuǎn)歸的監(jiān)測，即移植后BMSCs的分布、活性、分化、凋亡情況的監(jiān)測，一直是干細(xì)胞研究的重要方向[3-4]。采用組織病理學(xué)觀察的方法進(jìn)行移植BMSCs監(jiān)測需要離體進(jìn)行，屬于有創(chuàng)檢測技術(shù)[5]。利用現(xiàn)代多模態(tài)分子影像學(xué)技術(shù)可實現(xiàn)對BMSCs在體、實時命運轉(zhuǎn)歸的示蹤監(jiān)測，能夠無創(chuàng)顯示BMSCs可能的演進(jìn)方向[6-7]。移植BMSCs的在體影像監(jiān)測包括兩個方面：一是BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤；二是在體BMSCs分化的示蹤?，F(xiàn)將有關(guān)BMSCs分子影像學(xué)示蹤技術(shù)的研究進(jìn)展綜述如下。

1 移植 BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤技術(shù)

對于移植BMSCs在體遷移、分布、定位的監(jiān)測，從實現(xiàn)技術(shù)上分為光學(xué)成像、核磁共振成像（MRI）、正電子成像（PET）和單光子成像（SPECT）；從實現(xiàn)方式上主要分為對BMSCs進(jìn)行直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種方法。

1.1 直接標(biāo)記法 一種方法是利用超順磁性氧化鐵納米顆粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）對BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，通過MRI移植觀察干細(xì)胞在腫瘤組織中的定位、遷移及分布。SPIO標(biāo)記BMSCs主要有兩種方法：一是將SPIO吸附于BMSCs表面，但網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)會清除SPIO標(biāo)記的細(xì)胞；二是細(xì)胞將SPIO通過直接吞飲作用、受體介導(dǎo)胞吞作用、轉(zhuǎn)染介導(dǎo)實現(xiàn)示蹤劑內(nèi)在化[8-9]。商品名為菲立磁的SPIO是被美國FDA批準(zhǔn)上市的用于臨床MRI成像的示蹤劑。SPIO標(biāo)記屬于外源性鐵直接標(biāo)記MRI成像。有學(xué)者利用SPIO標(biāo)記干細(xì)胞在體治療軟骨缺損病，在不同時間點行3.0 T MRI掃描，計算T2值作為定量指標(biāo)，同時利用影像評分法觀察軟骨組織修復(fù)情況，結(jié)果顯示，SPIO標(biāo)記技術(shù)有助于利用MRI早期判斷干細(xì)胞治療大型動物模型軟骨缺損是否成功[10]。SPIO具有粒徑小、穿透力強、磁標(biāo)時間長的特點，移植后至少在18周內(nèi)可檢測到磁標(biāo)細(xì)胞，且弛豫率約為同樣條件下釓離子（Gd3+）的7～10倍, 在很低濃度(nmol級)即可在MRI上形成對比，最主要的是，經(jīng)SPIO標(biāo)記后的BMSCs不改變特性，SPIO對BMSCs無毒性作用、可降解，并且改變粒徑可以改變磁性[11]。甚至有研究表明，SPIO標(biāo)記對干細(xì)胞的生長及其組織修復(fù)功能都有增強作用，低強度靜磁場可以增強SPIO協(xié)助促進(jìn)的成骨分化效應(yīng)[12]。SPIO主要縮短T2時間，T2信號減低，與周圍組織形成良好對比，即使低濃度也能成像[13]。SPIO磁標(biāo)細(xì)胞的缺點有：①顆粒會導(dǎo)致信號丟失而產(chǎn)生“黑洞”；②鐵因干細(xì)胞的增生分裂而被稀釋，使得磁標(biāo)記的強度下降，因而MRI測定的敏感性降低；③標(biāo)記細(xì)胞死亡后可釋放含鐵標(biāo)記物，可能會將周圍未標(biāo)記的細(xì)胞標(biāo)記從而產(chǎn)生假陽性[14-15]。

直接標(biāo)記移植BMSCs的另一個方法是熒光成像技術(shù)。熒光成像技術(shù)中碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）技術(shù)在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用已得到拓展。CQDs表面有豐富的羧基基團(tuán)，通過偶聯(lián)作用可以實現(xiàn)與SPIO結(jié)合，通過吞飲作用進(jìn)入BMSCs內(nèi)，實現(xiàn)穩(wěn)定標(biāo)記，且不改變BMSCs的理化性質(zhì)，并具有通過不同波長的熒光激發(fā)實現(xiàn)多顏色熒光成像的優(yōu)勢[16-17]。

1.2 間接標(biāo)記法 間接標(biāo)記法主要利用BMSCs是基因良好載體這一特性，有學(xué)者指出，BMSCs是基因治療中理想的載體細(xì)胞，在BMSCs移植前，將多種外源性目的基因整合至BMSCs基因組中，BMSCs不僅能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)外源性基因，而且能夠定向分化，修補受損的組織[18]。對BMSCs進(jìn)行基因修飾，使之?dāng)y帶分子影像探針基因，可以實現(xiàn)對其示蹤。有學(xué)者對BMSCs進(jìn)行跨膜蛋白-鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)染，使之高表達(dá)鐵轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白具有聚集鐵離子的能力，從而產(chǎn)生內(nèi)源性鐵-MRI信號成像，實現(xiàn)對BMSCs的示蹤，其優(yōu)點在于使用內(nèi)源性鐵離子成像，無需外源性探針標(biāo)記，且內(nèi)源性鐵離子表達(dá)穩(wěn)定；缺點是伴隨鐵離子集聚會增加活性氧含量，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這成為阻礙在臨床上開展成像示蹤的原因，并且，隨著細(xì)胞的分裂，信號會丟失[19-20]。雖然如此，間接標(biāo)記法仍優(yōu)于直接標(biāo)記，因其更能體現(xiàn)BMSCs的活力狀態(tài)以及提供更多的細(xì)胞功能信息。另有作者將鐵蛋白重鏈（FTH）和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）兩個報告基因同時轉(zhuǎn)染BMSCs對BMSCs進(jìn)行示蹤，進(jìn)行體外小動物MRI成像，結(jié)果顯示報告基因能夠為MRI成像提供足夠的信號強度，能夠在體內(nèi)對BMSCs的遷移和分布進(jìn)行MRI示蹤，并且研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)報告基因轉(zhuǎn)染的BMSCs不影響B(tài)MSCs的生物學(xué)特性[21]，這為開展基于內(nèi)源性鐵MRI成像示蹤開辟了新途徑。還有研究者將跨膜蛋白碘化鈉轉(zhuǎn)運體（NIS）的基因?qū)隑MSCs內(nèi)并行正電子核素124I標(biāo)記，將BMSCs細(xì)胞移植至肝癌組織中，可以通過124I-PET 監(jiān)測BMSCs在肝癌組織中的活動情況，且NIS不改變BMSCs的理化性質(zhì)，其另一優(yōu)點是124I半衰期（半衰期4.2 d）較長，適合較長時間反復(fù)觀察[22-23]。

直接標(biāo)記和間接標(biāo)記示蹤移植干細(xì)胞都有缺點，因此，基于BMSCs是基因良好載體這一特性，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)、不改變BMSCs生物學(xué)特性、易于標(biāo)記的多模態(tài)分子影像探針，結(jié)合直接標(biāo)記和間接標(biāo)記的優(yōu)點，解決BMSCs轉(zhuǎn)歸的在體、實時分子影像監(jiān)測問題是現(xiàn)代干細(xì)胞治療的課題之一。多模態(tài)分子影像探針解決了多分子探針重復(fù)成像的弊端，還可通過基因轉(zhuǎn)染實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)和標(biāo)記，適合長期反復(fù)使用。

2 移植BMSCs在體分化的示蹤技術(shù)

通過以上所述的示蹤技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)外BMSCs的遷移、分布、定位的多模態(tài)分子影像學(xué)監(jiān)測。然而，在動物模型上的活體BMSCs分化示蹤由于受到某些因素如成像所需分化細(xì)胞數(shù)量級別、差異性分子影像探針構(gòu)建和成像設(shè)備分辨率等的限制而進(jìn)展緩慢，而對BMSCs在體分化進(jìn)行示蹤監(jiān)測更有價值和研究意義，可以實現(xiàn)追蹤BMSCs在特定微環(huán)境下定向誘導(dǎo)分化的去向。因此，BMSCs分化轉(zhuǎn)歸的在體示蹤技術(shù)受到關(guān)注。BMSCs分化示蹤可以分為細(xì)胞學(xué)水平示蹤和動物模型水平示蹤兩個層次。要完成BMSCs分化轉(zhuǎn)歸的示蹤，必須借助分子生物學(xué)研究的最新技術(shù)。

2.1 報告基因BMSCs成像 典型的報告基因成像技術(shù)是熒光蛋白成像，熒光蛋白成像目前多限于基礎(chǔ)生物學(xué)研究。熒光蛋白基因通過病毒和質(zhì)粒等載體與目的蛋白基因整合后，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并在激發(fā)光照射下發(fā)出熒光。在體小動物報告基因成像原理是，BMSCs在特定微環(huán)境誘導(dǎo)下的定向分化過程中，會有某些特異性生物活性因子的表達(dá)，利用其中某種特異性生物活性因子基因作為目的基因，利用該目的基因表達(dá)的特異性活性蛋白（或因子）作為啟動子驅(qū)動MRI報告基因表達(dá)，可實現(xiàn)通過MRI報告基因成像監(jiān)測BMSCs的定向分化；反之，當(dāng)組織中出現(xiàn)某些特異性生物活性因子表達(dá)升高時可以說明BMSCs的分化狀態(tài)及其特定分化方向，因此將某種特異性生物活性因子基因作為啟動子基因就可以實現(xiàn)BMSCs特定方向分化的示蹤，基于磁性物質(zhì)內(nèi)源性鐵MRI成像成為研究的首選報告基因。有研究者通過構(gòu)建神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）啟動子驅(qū)動FTH1基因表達(dá)的慢病毒（NSE-FTH1）載體并轉(zhuǎn)染BMSCs，并將轉(zhuǎn)基因BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，檢測其FTH1的表達(dá)及MRI信號變化，研究NSE啟動子驅(qū)動FTH1基因表達(dá)的變化并利用MRI成像監(jiān)測BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的可行性，結(jié)果顯示，NSE啟動子在BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中能特異性地啟動報告基因FTH1表達(dá)，并且MRI信號也發(fā)生改變，作者認(rèn)為基于NSE啟動子報告基因內(nèi)源性鐵MRI成像可用于BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的監(jiān)測[24]?？梢姡ㄟ^基因轉(zhuǎn)染技術(shù)實現(xiàn)BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像是可以實現(xiàn)的，但特異性高表達(dá)基因的啟動子的尋找是實現(xiàn)BMSCs定向分化過程中分化示蹤的關(guān)鍵。

2.2 調(diào)控表達(dá)報告基因BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像 報告基因成像技術(shù)雖然可以實現(xiàn)BMSCs定向分化示蹤，但是這時的BMSCs分化是人為啟動的、非正常BMSCs生理狀態(tài)下、非自然發(fā)生的，人為干預(yù)可能改變BMSCs的生物學(xué)行為。有研究采用四環(huán)素誘導(dǎo)Tet-On/Tet-Off基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，攜帶自殺基因治療間變型甲狀腺癌，取得良好的效果[25]。利用這個思路，可利用四環(huán)素衍生物強力霉素作為通用誘導(dǎo)啟動子調(diào)控跨膜蛋白如NIS或TfR、FTH目的基因的表達(dá), 且可以有效調(diào)控基因表達(dá)的時間和水平[26-28]，即當(dāng)BMSCs在特定微環(huán)境下發(fā)生定向分化時啟動目的基因的表達(dá)，實現(xiàn)BMSCs分化示蹤。因此可以進(jìn)行如下設(shè)計：可以將NIS和TfR、FTH基因整合到Tet-On/Tet-Off基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)中作為載體，基因轉(zhuǎn)染BMSCs，通過強力霉素作為誘導(dǎo)啟動子，在BMSCs開始分化的時間段內(nèi)開啟NIS或TfR基因的表達(dá)，并進(jìn)行多模態(tài)分子影像成像，通過對成像規(guī)律的總結(jié)與分子生物學(xué)結(jié)果的互證實現(xiàn)對BMSCs分化的在體示蹤監(jiān)測。但BMSCs體外細(xì)胞學(xué)容易觀察到定向分化時間，而在體動物模型或人體中難以準(zhǔn)確觀察到定向分化時間。這就需要用到篩選BMSCs定向分化最終細(xì)胞與BMSCs的分子生物標(biāo)志物的差異技術(shù)。

2.3 自動調(diào)控表達(dá)報告基因BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像 采用荷肝癌鼠血清作為誘導(dǎo)刺激培養(yǎng)基，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs，miRNA 微陣列技術(shù)分析BMSCs表達(dá)譜的差異，篩選差異最顯著的miRNA，將顯著變化的miRNAs輸入miRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行下游目的基因的預(yù)測。在體動物模型根據(jù)該目的基因表達(dá)相應(yīng)蛋白水平將其作為指示因子（非啟動子），啟動Tet-On/Tet-Off基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)實現(xiàn)靶基因（如NIS和TfR、FTH）表達(dá)[29]，進(jìn)行在體分子影像學(xué)BMSCs示蹤成像。更進(jìn)一步設(shè)計，并在此基礎(chǔ)上，探索設(shè)計特異性啟動子（specific promoter），當(dāng)目的基因表達(dá)出現(xiàn)差異時，該特異性啟動子啟動靶基因（如NIS或TfR、FTH）的表達(dá)，進(jìn)行MRI分子影像學(xué)成像，觀察成像規(guī)律，實現(xiàn)在體BMSCs定向分化的在體示蹤。

雖然通過這種設(shè)計，理論上可以實現(xiàn)BMSCs的分化的自動示蹤，但也存在諸多問題，比如BMSCs內(nèi)轉(zhuǎn)染多種生物活性因子后，對BMSCs的定向分化是否會有影響？對干細(xì)胞的生物活性是否存在影響？由此可見，實現(xiàn)BMSCs的在體分化示蹤需要多種生物技術(shù)進(jìn)行合力攻關(guān)。

目前，BMSCs遷移、分布、定位的在體示蹤技術(shù)通過合適的標(biāo)記技術(shù)基本可以實現(xiàn)，尤其是通過基因修飾實現(xiàn)多模態(tài)分子影像成像成為可能。相比較而言，BMSCs分化的在體多模態(tài)分子影像示蹤技術(shù)實現(xiàn)較為困難，主要與靶分子的標(biāo)記、分化后的降解、設(shè)備的分辨率有關(guān)，但通過多種生物學(xué)技術(shù)的合理應(yīng)用將有望實現(xiàn)BMSCs在體分化的多模態(tài)分子影像示蹤。設(shè)計簡單易行、特異性強、靈敏度高、細(xì)胞毒性低、受外界干擾小以及移植干細(xì)胞的長期定量等優(yōu)點的內(nèi)、外源分子影像探針是科研攻關(guān)的目標(biāo)。