李燕宏,丁 鑫,杜 堅,張紅梅

腦梗死又稱缺血性腦卒中,是由各種原因引起的局部腦組織缺血缺氧性壞死,進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。由于大多數(shù)腦梗死是血栓堵塞腦動脈所致,血小板聚集又是血栓形成的關(guān)鍵步驟,因而抗血小板聚集治療一直是治療和預(yù)防這類疾病的重要手段[1]。為此,腦梗死病人需要長期服用阿司匹林等抗血小板藥聚集物來預(yù)防疾病的發(fā)生。而在腦梗死治療過程中,病人腦組織結(jié)構(gòu)與功能的修復(fù)主要依賴于病灶區(qū)的神經(jīng)元再生和血管重建過程[2-4]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)被認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生與修復(fù)中起著重要作用[3]。那么,這些抗血小板聚集藥物是否能調(diào)控NSCs 目前少有報道。磷酸二酯酶3 型抑制劑西洛他唑(cilostazol)作為一種抗血小板藥物,常用于缺血性腦卒中的治療[5]。近年來,有研究顯示,除了抗血小板聚集的作用以外,西洛他唑在減少血管意外事件方面要優(yōu)于阿司匹林[6];單獨應(yīng)用西洛他唑也能減輕動物模型的腦梗死區(qū)范圍[7]。但是,西洛他唑是否通過調(diào)節(jié)NSCs 而介導(dǎo)對腦梗死的保護(hù)性作用目前并不清楚。為此,本研究通過小鼠海馬NSCs 糖氧剝奪性損傷模型,探討西洛他唑?qū)π∈蠛ｑRNSCs 的保護(hù)性作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級C57BL/6 小鼠(8 周齡)由成都醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。雌鼠、雄鼠按照2∶1 比例合籠喂養(yǎng),雌鼠交配受孕后自然分娩。取其1 d 齡新生C57BL/6 小鼠,用于海馬NSCs 的分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品及試劑 西洛他唑購自Sigma-Aldrich 公司;抗Nestin(批號:ab105389)、Alexa Fluor 488 熒光標(biāo)記二抗IgG(批號:ab150077)、抗Bax(批號:ab32503)、抗Bcl-2(批號:ab196495)、抗C/EBP 同源蛋白(CHOP,批號:ab179823)購自Abcam 公司;抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自Santa Cruz公司(批號:sc-25778);抗活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4,ATF-4)抗體購自Cell Signaling技術(shù)公司(批號:11815);ATF-4 siRNA 由銳博生物公司合成,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 購自Invitrogen公司;CCK-8 檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司(批號:C0042)。

1.2 海馬NSCs 的分離培養(yǎng)及鑒定 海馬NSCs 的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[8]提供的方法。取新生C57BL/6幼鼠(1 d 齡),經(jīng)5%乙醇浸泡消毒,在超凈工作臺內(nèi)斷頭取腦,小心分離海馬組織,剪碎后加入0.25%胰酶于37 ℃消化15 min,采用DMEM 培養(yǎng)基終止消化,低速離心(1 500 r/min)后吸去上清液,沉淀細(xì)胞經(jīng)DMEM 培養(yǎng)基重懸,200 目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾,再次離心并棄上清,用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度以1×109個/ L 密度接種于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 更換培養(yǎng)液1 次,每6～7 d 傳代培養(yǎng)。給藥前,取第3 代NSCs 接種于六孔板中培養(yǎng),接種密度1.0×106個/孔。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時,即用于藥物處理。

為了鑒定NSCs,部分NSCs 接種于六孔板中,貼壁培養(yǎng)4 h 后吸去培養(yǎng)基,加4%多聚甲醛固定,0.3%Triton-100 通透細(xì)胞膜,山羊血清封閉,加稀釋比1∶100的抗Nestin 抗體于4 ℃下孵育過夜,經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗后,再加Alexa Fluor 488 熒光標(biāo)記二抗IgG 孵育2 h,加4",6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核,封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 糖氧剝奪性損傷模型制作及分組藥物處理 糖氧剝奪性損傷模型制作的簡要過程:待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時,將培養(yǎng)基更換為無糖DMEM 培養(yǎng)基,并將NSCs 置于通1%O2、5%CO2乏氧混合氣體的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。

分組處理時,將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組、西洛他唑組、siRNA 空白對照組、ATF-4 siRNA 組。對照組NSCs 事先不做糖氧剝奪性損傷處理,直接采用正常糖含量的培養(yǎng)基培養(yǎng),在正常氧含量混合氣體的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。其他各組NSCs 預(yù)先進(jìn)行糖氧剝奪處理3 h,隨后其培養(yǎng)液更換為正常糖含量的DMEM 培養(yǎng)基,置于正常氧含量混合氣體的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。為了觀察干擾ATF-4 對NSCs的影響,ATF-4 siRNA 組在接受糖氧剝奪損傷處理之前1 h,培養(yǎng)液即更換為含100 nmol/L ATF-4 siRNA 的DMEM 培養(yǎng)基。而siRNA 空白對照組NSCs 則在糖氧剝奪處理之前1 h開始接受100 nmol/L轉(zhuǎn)染溶劑lipofectamine 2000 處理。NSCs 轉(zhuǎn)染ATF-4 siRNA或溶劑lipofectamine 2000 的過程將持續(xù)至糖氧剝奪后24 h。西洛他唑組在糖氧剝奪處理后,其培養(yǎng)液更換為含10μmol/L 西洛他唑的DMEM 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。西洛他唑劑量參考文獻(xiàn)[9]。藥物處理完畢,即收集細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測分析。

另外,在檢測西洛他唑?qū)SCs 增殖活力影響的劑量效應(yīng)關(guān)系實驗中,西洛他唑組再分為3 個亞組:低劑量西洛他唑組(1 μmol/L)、中劑量西洛他唑組(3μmol/L)、高劑量西洛他唑組(10μmol/L)。

1.4 NSCs 增殖活力檢測 采用CCK-8 法。NSCs 以5.0×103個/孔密度接種于96 孔板,每組6 個復(fù)孔。糖氧剝奪和藥物處理過程同上所述。藥物處理過程完成后,各組培養(yǎng)板中每孔置換為新鮮100 μL 培養(yǎng)液,再加入10 μL 的CCK-8 溶液,37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用SynergyH1 多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek 公司)檢測各孔450 nm 處吸光值,以此作為細(xì)胞活力指證。

1.5 NSCs 中ATF-4、CHOP、Bax、Bcl-2 表達(dá)量檢測 采用免疫印跡(Western Blotting)法。藥物處理過程完成后,各組細(xì)胞經(jīng)冷PBS 漂洗2 次,加RIPA 裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解細(xì)胞樣本。隨后,裂解混合液經(jīng)4 ℃離心(12 000 r/min)10 min。所收集的蛋白濃度采用BCA 法定量。然后,每泳道加入50 μg 蛋白,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,并電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF 膜加5%脫脂牛奶液在室溫下封閉2 h;隨后加一抗(抗ATF-4、抗CHOP、抗Bax、抗Bcl-2、抗GAPDH)4 ℃孵育過夜,漂洗3 次;再加辣根過氧化物酶(HRP)連接的二抗羊抗兔IgG 孵育1 h,再洗脫;加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑,以顯示待測蛋白條帶。蛋白條帶圖像掃描至電腦存儲,利用ImageJ 1.43u 軟件分析各條帶的灰度值。其中,Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)量比值(即凋亡指數(shù))用于衡量細(xì)胞凋亡程度,比值越高表示凋亡越強(qiáng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 西洛他唑?qū)μ茄鮿儕Z下海馬NSCs 增殖與凋亡的影響 免疫熒光檢測結(jié)果顯示,鏡下可見大多數(shù)細(xì)胞染色呈Nestin 陽性的亮綠色,被染色細(xì)胞即為NSCs。詳見圖1。

圖1 海馬NSCs 的免疫熒光技術(shù)鑒定

CCK-8 法檢測海馬NSCs 增殖活力:與對照組比較,模型組海馬NSCs 增殖活力明顯下降(P＜0.01);與模型組、低劑量西洛他唑組比較,中劑量西洛他唑組、高劑量西洛他唑組海馬NSCs 的增殖活力明顯提高(P＜0.01)。根據(jù)NSCs 增殖活力實驗研究結(jié)果,本研究后續(xù)實驗中只選取高劑量(10 μmol/L)西洛他唑作為藥物治療組。Western Blot 檢測Bax/Bcl-2 表達(dá):與對照組比較,模型組Bax/Bcl-2 明顯增加(P＜0.01);與模型組比較,中劑量西洛他唑組、高劑量西洛他唑組Bax/Bcl-2 明顯降低(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組海馬NSCs 增殖活力和Bax/Bcl-2 比較(±s)

表1 各組海馬NSCs 增殖活力和Bax/Bcl-2 比較(±s)

與對照組相比,①P ＜0.01;與模型組相比,②P ＜0.01;與低劑量西洛他唑組相比,③P ＜0.01;與siRNA 空白對照組相比,④P ＜0.01。

組別 只數(shù) NSCs 增殖活力 Bax/Bcl-2對照組 10 0.98±0.08 0.64±0.05模型組 10 0.62±0.05① 1.98±0.14①低劑量西洛他唑組 10 0.66±0.05 1.99±0.15中劑量西洛他唑組 10 0.90±0.06②③ 0.98±0.08②③高劑量西洛他唑組 10 0.99±0.08②③ 0.66±0.05②③siRNA 空白對照組 10 0.61±0.04① 1.97±0.14①ATF-4 siRNA 組 10 0.97±0.07④ 0.68±0.05④

2.2 西洛他唑?qū)μ茄鮿儕Z下海馬NSCs 中ATF-4、CHOP 信號通路表達(dá)的影響 與對照組比較,模型組海馬NSCs 中ATF-4、CHOP 表達(dá)量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較,高劑量西洛他唑組ATF-4、CHOP 表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。詳見表2。

表2 各組ATF-4/CHOP 信號通路表達(dá)比較(±s)

表2 各組ATF-4/CHOP 信號通路表達(dá)比較(±s)

與對照組相比,①P ＜0.01;與模型組相比,②P ＜0.01;與siRNA 空白對照組相比,③P ＜0.01。

組別 只數(shù) ATF-4 CHOP對照組 10 0.32±0.02 0.45±0.04模型組 10 0.91±0.06① 1.02±0.07①高劑量西洛他唑組 10 0.34±0.03② 0.47±0.04②siRNA 空白對照組 10 0.90±0.07① 1.05±0.07①ATF-4 siRNA 組 10 0.33±0.03③ 0.48±0.05③

2.3 干擾ATF-4 對糖氧剝奪下海馬NSCs 增殖與凋亡的影響 ATF-4 siRNA 在抑制ATF-4、CHOP 信號通路表達(dá)的同時,也明顯升高NSCs 增殖活力(P＜0.01)和降低Bax/Bcl-2(P＜0.01)。詳見表1、表2。

3 討 論

人口老齡化已經(jīng)成為當(dāng)今全球最為關(guān)注的問題之一。隨著老齡化程度的日益加重,各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如腦梗死、阿爾茨海默病、帕金森病等)的發(fā)病率正急劇攀升[10]。NSCs 移植被認(rèn)為是治療這些疾病的重要手段,主要是因為NSCs 可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生與修復(fù)中起著重要作用[11]。內(nèi)源性NSCs 主要定位于海馬齒狀回、室管膜下區(qū)[12]。腦梗死時引起的局部腦組織血流突然終止,可通過糖氧剝奪的方式損傷腦內(nèi)NSCs,使NSCs失去參與神經(jīng)系統(tǒng)再生修復(fù)的能力[13]。因此,在腦梗死治療實踐中,務(wù)必關(guān)注各種治療藥物對腦內(nèi)NSCs功能的影響,注重保護(hù)和改善腦內(nèi)NSCs 的功能。為此,本研究觀察常用抗血小板藥西洛他唑?qū)ｑRNSCs 糖氧剝奪性損傷的保護(hù)性作用。本研究結(jié)果顯示,西洛他唑能通過改善海馬NSCs 的增殖活力和抑制其細(xì)胞凋亡過程,從而抑制NSCs 的糖氧剝奪性損傷。因此,西洛他唑可能對維持腦梗死后NSCs 的神經(jīng)再生能力具有一定保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步探討西洛他唑保護(hù)海馬NSCs 的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,本研究探討了ATF-4、CHOP 信號通路與海馬NSCs 糖氧剝奪性損傷之間的關(guān)系,研究結(jié)果顯示,糖氧剝奪性損傷可激活海馬NSCs 中的ATF-4、CHOP信號通路;西洛他唑則下調(diào)ATF-4、CHOP 信號通路;采用ATF-4 siRNA 干擾抑制ATF-4、CHOP 信號通路,則明顯提升NSCs 增殖活力和降低其細(xì)胞凋亡水平。事實上,ATF-4、CHOP 信號通路在心肌細(xì)胞[14]、胰腺β細(xì)胞[15]、神經(jīng)元[16]等細(xì)胞的凋亡過程中都起著重要作用。盡管有實驗證實CHOP 在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡中起著重要作用[17],但是ATF-4、CHOP 信號通路在NSCs 凋亡中的作用并不清楚。本研究結(jié)果則明確提示,ATF-4、CHOP 信號通路在糖氧剝奪誘導(dǎo)的海馬NSCs 凋亡中起著重要作用,采用ATF-4 siRNA 干擾技術(shù)抑制ATF-4、CHOP 信號通路則明顯抑制NSCs糖氧剝奪性凋亡。同時,本研究結(jié)果也證實西洛他唑?qū)SCs 糖氧剝奪性損傷的保護(hù)作用與其抑制ATF-4、CHOP 信號通路有關(guān)。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,糖氧剝奪通過上調(diào)ATF-4、CHOP 信號通路而促進(jìn)海馬NSCs 凋亡,從而影響其參與腦梗死時神經(jīng)再生的能力。西洛他唑則通過抑制ATF-4/CHOP 信號通路,從而抑制NSCs 凋亡和改善海馬NSCs 糖氧剝奪性損傷。另外,以往研究提示,腦缺血可導(dǎo)致腦組織ATF-4、CHOP 表達(dá)上調(diào)[18-21]。本研究結(jié)果提示,ATF-4、CHOP 信號通路可能是防治腦梗死等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要靶點。