張興博,梁健芬,陳 煒,徐柳炎,蒙健林

帕金森病(Parkinson"s disease,PD)是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,同時也是中老年人致殘的主要原因之一,其病理變化主要為黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的變性缺失。在PD 發(fā)病過程中,大量的α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)異常折疊和聚集依舊是PD 發(fā)病的中心事件[1],而激活自噬可加速α-syn 的降解進而參與PD 的發(fā)病[2],同時,PD 多巴胺能神經(jīng)元自噬又受到轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)的調(diào)控,現(xiàn)已證實,在PD 細胞自噬過程中TFEB是多巴胺能神經(jīng)元自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號分子,其可通過調(diào)控自噬,阻斷異構(gòu)α-syn 蛋白聚集[3],進而阻止多巴胺能神經(jīng)元死亡。本研究以魚藤酮誘導(dǎo)的PD 大鼠作為研究對象,在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下,給予加味五虎追風(fēng)散治療,觀察其對PD 大鼠黑質(zhì)TFEB、微管相關(guān)膜蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)Ⅱ、泛素結(jié)合蛋白P62(P62)、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白表達的影響及對α-syn 的清除作用,以探討加味五虎追風(fēng)散治療PD 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠60 只,雄性,體重200～250 g,實驗動物由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(動物合格證號SCXK 桂2009-0002)。所有大鼠在通風(fēng)良好的條件下分籠飼養(yǎng),自由攝食及飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器 加味五虎追風(fēng)散方藥組成:蟬蛻6 g,天南星6 g,天麻12 g,全蝎3 g,僵蠶10 g,大地棕根15 g。使用中藥配方顆粒劑,由江陰天江藥業(yè)有限公司提供,產(chǎn)品批號:1401018。魚藤酮、葵花乳油均購自Sigma 公司;兔多克隆α-syn 抗體、兔多克隆LC3 抗體、兔源P62 多克隆抗體均購自英國Abcam 公司;鼠抗酪氨酸羥化酶抗體購自北京碧云天生物有限公司;Actin 抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;其他試劑均為市售、分析純化。

1.3 模型制備及給藥方法 將大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)、行為學(xué)訓(xùn)練(大鼠爬桿實驗和轉(zhuǎn)棒耐力)1 周,將60 只大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組,各20 只。模型組、中藥組大鼠采用魚藤酮頸背部皮下注射構(gòu)建PD大鼠模型,配制魚藤酮葵花油乳化液,濃度為2 mg/mL,造模劑量為2 mg/kg,每日按時頸部、背部交替皮下注射。正常組注射不含魚藤酮的等量葵花油乳化劑,給藥4 周,造模結(jié)束后參照陳忻等[4]的行為學(xué)評分標準,行為學(xué)評分在2～8 分的大鼠視為造模成功,最終模型組及中藥組各造模成功16 只,正常組死亡4 只。中藥組給予加味五虎追風(fēng)散灌胃,給藥量為生藥608.4 mg/kg,按照該給藥劑量,將加味五虎追風(fēng)散配制成16.30 mg/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用,灌胃液體量為2 mL/100 g,每日2 次,間隔12 h。正常組及模型組給予等量無菌蒸餾水代替灌胃。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)染色法測定黑質(zhì)TH 陽性細胞數(shù)目 大鼠斷頭取腦,4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h,然后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗30 min×3 次,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,快速冷凍切片,切片厚30μm,切片脫蠟,以0.01 mmol/L PBS 沖洗,用磷酸緩沖液配制的4% 多聚甲醛固定,然后按SABC(strept avidin-biotin complex)法進行免疫組化染色,以H2O2作用30 min,山羊血清封閉1 h,加兔抗、TH抗體(1∶10 000)分別室溫孵育1 h,4 ℃過夜,次日37℃孵育1 h;加入生物素標記的IgG 二抗室溫孵育2 h;加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。取黑質(zhì)致密部條帶區(qū)相同部位相鄰切片3 張,400 倍鏡下觀察計數(shù)雙側(cè)黑質(zhì)致密部條帶區(qū)TH 陽性細胞數(shù)量。

1.4.2 免疫印跡(Western Blot)法檢測TFEB、LC3Ⅱ、P62、α-syn、TH 蛋白表達 魚藤酮注射4 周后,將3 組大鼠斷頭取腦,分離出中腦黑質(zhì)組織,蛋白裂解后采用Western Blot 檢測TFEB、LC3Ⅱ、P62、α-syn、TH 蛋白表達。主要步驟:取材后將黑質(zhì)組織按照質(zhì)量體積比為1∶10 比例加入裂解液,冰上超聲處理10 s 后,沸水浴中5 min 變性,15 000 r/min 離心15 min,吸取上清液,每管20μL 分裝,-70 ℃保存。取10 μL 樣品,泳道上樣于12%聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進行凝膠電泳,4 ℃300 mA 電轉(zhuǎn)90 min。5%BSA-TBST 封閉1 h 后,加入相應(yīng)蛋白抗體,4 ℃過夜。TBST 緩沖液漂洗10 min×3 次后,加入二抗,室溫孵育1 h 后加入ECL 實時熒光定量試劑盒發(fā)光底物顯色?；瘜W(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影分析。用目的蛋白灰度值與胞漿蛋白內(nèi)參β-actin 灰度值之比計算蛋白的相對表達度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,若方差不齊采用方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3 組大鼠行為學(xué)比較 模型組出現(xiàn)拘捕行為,主動活動明顯減少、動作遲鈍緩慢,并伴有震顫及步態(tài)不穩(wěn),部分出現(xiàn)向單側(cè)進行斜臥;中藥組上述表現(xiàn)較模型組減輕。模型組行為學(xué)評分明顯高于正常組,中藥組行為學(xué)評分較模型組明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表1。

表1 3 組大鼠行為學(xué)評分比較(±s) 單位:分

表1 3 組大鼠行為學(xué)評分比較(±s) 單位:分

與正常組比較,①P ＜0.01;與模型組比較,②P ＜0.01。

組別 只數(shù) 行為學(xué)評分正常組 16 0模型組 16 5.33±1.13①中藥組 16 2.67±0.98①②

2.2 3 組大鼠中腦黑質(zhì)TH 神經(jīng)元數(shù)目比較 模型組大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH 神經(jīng)元數(shù)目較正常組明顯減少,與模型組比較,中藥組TH 神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。說明加味五虎追風(fēng)散在一定程度上可以抑制PD 大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷。詳見表2。

表2 3 組中腦黑質(zhì)TH 神經(jīng)元數(shù)目比較( ±s) 單位:個

表2 3 組中腦黑質(zhì)TH 神經(jīng)元數(shù)目比較( ±s) 單位:個

與正常組比較,①P ＜0.01;與模型組比較,②P ＜0.01。

組別 只數(shù) TH 陽性神經(jīng)元數(shù)目正常組 16 64.2±6.8模型組 16 27.4±5.7①中藥組 16 36.2±4.9①②

2.3 3 組大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)TFEB、LC3Ⅱ、P62、TH 及α-syn表達比較 與正常組比較,模型組黑質(zhì)內(nèi)LC3Ⅱ、P62、α-syn 蛋白表達明顯增高(P＜0.05 或P＜0.01),TH表達明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,中藥組TFEB、LC3Ⅱ及TH 表達水平明顯增加(P＜0.05 或P＜0.01),P62、α-syn 表達減少(P＜0.01)。說明加味五虎追風(fēng)散可增加TFEB 因子、自噬蛋白LC3Ⅱ及TH 的表達,進而減少P62、α-syn 的聚集。詳見表3。

表3 3 組腦內(nèi)黑質(zhì)TFEB、LC3Ⅱ、P62、TH 及α-syn 表達比較(±s)

表3 3 組腦內(nèi)黑質(zhì)TFEB、LC3Ⅱ、P62、TH 及α-syn 表達比較(±s)

與正常組比較,①P ＜0.05,②P ＜0.01;與模型組比較,③P ＜0.05,④P ＜0.01。

組別 只數(shù) LC3Ⅱ P62 TFEB α-syn TH正常組 16 1.17±0.33 0.96±0.19 0.77±0.10 0.63±0.03 1.23±0.15模型組 16 1.69±0.54② 1.34±0.47① 0.70±0.12 1.33±0.05② 0.67±0.09②中藥組 16 2.06±0.37②③ 0.56±0.16②③ 0.86±0.08②④ 1.08±0.04②④ 0.98±0.11②④

3 討 論

PD 屬中醫(yī)學(xué)“顫證”范疇,病位在腦,證屬本虛標實,腎虛為本病發(fā)病之根本,標實為痰瘀交阻生風(fēng)而致心神失主,經(jīng)脈肢體失控[5-6]。有文獻報道,加味五虎追風(fēng)散對保護多巴胺能神經(jīng)元功能有一定作用,但其具體機制尚未明確[7-8]。本研究采用加味五虎追風(fēng)散干預(yù)PD 模型大鼠,補腎生髓、化痰祛瘀、息風(fēng),正切合PD 病機。

目前研究發(fā)現(xiàn),PD 的發(fā)病與多種機制相關(guān),但多巴胺神經(jīng)元中出現(xiàn)路易小體并導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元損傷是PD 的病理特征[9],而α-syn 的折疊異常與聚集是產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)的主要原因,目前研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬功能障礙導(dǎo)致α-syn 清除障礙在PD 發(fā)病中有重要作用,LC3Ⅱ及P62 均與細胞自噬密切相關(guān),LC3Ⅱ作為細胞中自噬體的標志物之一,在自噬體形成各階段的內(nèi)外膜上均可以檢測到LC3Ⅱ,其含量與自噬泡的數(shù)量成正比,可反映自噬活性的高低;P62 是選擇性自噬的底物蛋白,其在LC3 和泛素化底物之間起連接作用,可以將LC3 和相應(yīng)的泛素化底物整合到自噬體中,最終在自噬溶酶體中降解。因此,P62 為判斷自噬降解的一個指標,以通過檢測P62 蛋白的表達量來觀測自噬流,隨著自噬過程的加強,P62 表達量通常下調(diào)[10]。

TFEB 是調(diào)控自噬-溶酶體系統(tǒng)的主要調(diào)控因子,可作為調(diào)節(jié)劑參與溶酶體合成和表達,調(diào)控細胞自噬,是調(diào)控細胞自噬的轉(zhuǎn)錄因子,當細胞中的平衡被外界打亂時,就會通過溶酶體來觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子,從而糾正外來的干擾[11],在過表達α-syn 的PD 動物模型中,TFEB 功能受損可增加α-syn 對多巴胺能神經(jīng)元的毒性,TFEB 過表達則可增強細胞自噬功能,促進α-syn清除[12]。

環(huán)境毒素魚藤酮引起的LC3Ⅱ表達量增高并非由于自噬激活,而是自噬流受阻導(dǎo)致自噬體降解障礙產(chǎn)生堆積。本研究發(fā)現(xiàn),魚藤酮頸背部皮下注射誘導(dǎo)的PD 大鼠模型中,模型組大鼠黑質(zhì)紋狀體有大量α-syn聚集,同時發(fā)現(xiàn)模型組大鼠LC3Ⅱ、P62 增加,TH 減少,說明魚藤酮有抑制自噬流的作用,可能抑制自噬體的降解引起自噬體堆積,經(jīng)加味五虎追風(fēng)散干預(yù)后可見TFEB、LC3Ⅱ明顯增加,P62 及α-syn 明顯降低,說明PD 大鼠紋狀體神經(jīng)細胞自噬活性降低與α-syn 沉積有關(guān)。已有研究證明,α-syn 的異常聚集導(dǎo)致TH 活性下降,表達減少,進一步導(dǎo)致多巴胺變性死亡[13]。本實驗表明,自噬蛋白LC3Ⅱ表達增加,P62 表達減少后α-syn 表達隨之減少,反之LC3Ⅱ表達減少,P62 表達增加后α-syn 表達增加,TH 減少,多巴胺神經(jīng)元死亡;而加味五虎追風(fēng)散可通過調(diào)節(jié)TFEB、LC3Ⅱ及P62 的表達進一步減少α-syn 的聚集,從而發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)元的保護作用。

綜上所述,加味五虎追風(fēng)散可保護魚藤酮所致的多巴胺能神經(jīng)元損傷,激活細胞自噬功能,而通過TFEB、LC3-Ⅱ及P62 促進α-syn 的自噬性清除可能是作用機制之一。這為PD 的病因治療提供了新的思路,同時為中醫(yī)藥治療PD 提供了理論依據(jù)。