王林，樊清清，段雯婷，王維

1.西安市第一醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710002；2.西安市第一醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710002；3.西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710002；4.西安市兒童醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710003

越來越多的流行病學(xué)證據(jù)表明，以脂肪堆積過多為特征性病變的肥胖，已經(jīng)快速發(fā)展成全球性的健康問題[1]。肥胖不僅可以引起身體各種代謝并發(fā)癥，亦可增加患者罹患多種激素依賴性腫瘤的風險，同時顯著促進腫瘤的進展及不良預(yù)后過程，此現(xiàn)象在絕經(jīng)后婦女乳腺癌患者的病例中尤為顯著[2-4]。眾所周知，細胞因子、炎性趨化因子和脂肪因子分泌失調(diào)所導(dǎo)致的脂肪細胞增生、肥大參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程。在眾多因子中，有致癌性的脂肪因子——瘦素(Leptin)，被認為是關(guān)聯(lián)肥胖和乳腺癌的一種最重要的分子中介。相比于正常乳腺上皮細胞，瘦素在乳腺腫瘤細胞中過表達[5-7]。另有研究表明，Leptin 受體(Ob-R)廣泛表達于人體內(nèi)各種組織及腫瘤細胞上，Leptin 通過與腫瘤細胞上的Ob-R 結(jié)合可誘導(dǎo)其生存、遷移、侵襲等特性[8-9]。事實上除了研究Leptin 促進腫瘤細胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程，人們對于Leptin 在乳腺癌細胞上皮細胞間質(zhì)化(EMT)過程中所發(fā)揮的作用較少研究。

EMT 是貼壁上皮樣細胞到間充質(zhì)樣細胞表型轉(zhuǎn)換的過程，在胚胎形成、組織修復(fù)、傷口愈合以及各種病理情況如惡性腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。近期研究表明EMT 是多種癌癥進展中的一個重要的啟動因子，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及不良預(yù)后關(guān)系緊密[7，10-12]。發(fā)生EMT 的細胞，其上皮細胞標志物鈣黏蛋白(E-cadherin)表達受抑制，間質(zhì)細胞標志物如波形蛋白(Vimentin)表達升高。研究表明發(fā)生EMT的癌細胞可分泌多種細胞因子、生長因子和趨化因子，如白介素8(IL-8)[13]。IL-8是一種由巨噬細胞、上皮細胞等分泌的趨化因子，和包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞的增殖、血管形成、侵襲移擴散等過程密切相關(guān)[14]。

本研究以人乳腺癌MCF-7細胞為體外研究對象，分析Leptin 對其EMT 的作用并以趨化因子IL-8 為切入點探討其可能的分子途徑，為Leptin 參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制的闡明提供依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 材料 人MCF-7乳腺癌細胞株由西安市第一醫(yī)院檢驗科保存；Leptin 購買于Peprotech 公司；DMEM 培養(yǎng)基購買于Gibco 公司；胎牛血清購買于杭州四季青生物研究所；SDS-PAGE 蛋白緩沖液和封閉蛋白購買于武漢；蛋白Marker購買于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；細胞裂解液購買于碧云天生物研究所；HRP 發(fā)光試劑購買于Millipore公司；兔抗人Ob-R和IL-8 抗體購買于Santa Cruz 公司；兔抗人p-AKT、AKT 抗體購買于Cell Signaling 公司；兔抗人E-cadherin、Vimentin，鼠 抗 β-actin 抗 體 均 購 買 于Bioworld公司；二抗購于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7 細胞用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37℃、50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光法檢測MCF-7 細胞Leptin 受體Ob-R蛋白表達 取常規(guī)培養(yǎng)對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以3×105/孔的濃度于6孔板中培養(yǎng)，細胞加入兔抗人Ob-R(1:100)及FITC標記的二抗(羊抗兔IgG 1:1 000稀釋)，于熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)，其中細胞核經(jīng)DAPI染色。

1.2.3 顯微鏡觀察Leptin 對MCF-7 細胞形態(tài)的影響 實驗分為對照組、Leptin 處理組，取對數(shù)期的MCF-7 細胞，經(jīng)2.5 g/L 胰酶消化和磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用DMEM 培養(yǎng)液重懸，使細胞濃度為3×105/mL，按100 μL/孔的量加入 6 孔板中，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng) 16 h，細胞同步化后，經(jīng) 3 遍 PBS 清洗后加入DMEM培養(yǎng)液，PBS組、Leptin組分別經(jīng)PBS及100 ng/mL Leptin處理，作用48 h 后，于顯微鏡觀察MCF-7細胞形態(tài)。

1.2.4 Western blot 法檢測 Leptin 對 MCF-7 細胞EMT 相關(guān)蛋白 E-cadherin、Vimentin 表達的影響 實驗分組及處理同1.2.3，作用48 h 后，按試劑盒要求提取總蛋白，取120 μg 總蛋白行100 g/L SDS-PAGE，經(jīng)干轉(zhuǎn)的PVDF膜以TBST(含50 g/L脫脂奶粉)4℃封閉4 h后加入兔抗人E-cadherin，Vimentin(1∶1 000)一抗于4℃孵育過夜，經(jīng)2次TBST洗滌和1次TBS洗滌；加入二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000 稀釋)室溫孵育1 h，重復(fù)洗滌過程；滴加HRP 發(fā)光試劑，于暗室靜置2 min，應(yīng)用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Quantity One4.6.6 軟件分析條帶光度值，檢測經(jīng)Leptin 作用后MCF-7 細胞 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達變化，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot 法檢測 Leptin 對 MCF-7 細胞IL-8 分泌及信號通路分子p-AKT 表達的影響 實驗分組、細胞處理及Western blot 檢測方法同上，其中一抗兔抗人 p-AKT、AKT，兔抗人 IL-8 按 1∶1 000 稀釋。檢測經(jīng)Leptin作用后MCF-7細胞IL-8、p-AKT蛋白的表達變化，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 免疫熒光法檢測IL-8 在Leptin 促MCF-7細胞EMT過程中的作用 實驗分為PBS組、Lepin組、Leptin+anti-IL-8組及Leptin+IgG組。后兩組在Leptin處理前1 h，分別加入IL-8 特異性抗體(1 μg/mL)及對照抗體IgG，孵育48 h，加入兔抗人E-cadherin、Vimentin (1∶100 稀釋)及 FITC 標記的二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000 稀釋)，于熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7 細胞Ob-R 的表達 免疫熒光檢測表明 MCF-7 細胞 Ob-R 有表達(圖 1)。

圖1 免疫熒光檢測MCF-7細胞上Ob-R的表達(×400)

圖2 顯微鏡觀察Leptin對MCF-7細胞EMT過程的影響(×200)

2.2 Leptin對MCF-7細胞EMT過程的影響 顯微鏡形態(tài)觀察(圖2)檢測表明Leptin能引起MCF-7細胞發(fā)生EMT改變，形態(tài)表現(xiàn)為極性消失，黏附性下降，細胞間連接變松散。Western blot法(圖3)檢測上皮標記物E-cadherin和間質(zhì)標記物Vimentin蛋白的相對表達量，其中 E-cadherin 的表達 Leptin 組(0.14±0.04)較PBS 組(0.84±0.06)顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.033，P＜0.05)，Vimentin 的表達Leptin 組(1.04±0.14)較PBS 組(0.12±0.02)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.153，P＜0.05)。 以 上 結(jié) 果 均 表 明 Lepin 可 促 進MCF-7細胞上EMT過程。

圖3 Western blot檢測Leptin對MCF-7細胞EMT過程的影響

2.3 Leptin 促進 MCF-7 細胞 p-Akt 的表達及IL-8 的分泌 Western blot 法(圖 4)檢測 p-Akt、Akt、IL-8 蛋白的相對表達量，其中p-Akt 的表達Leptin 組(0.81±0.07)較PBS組(0.11±0.03)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.566，P＜0.05)，Akt 的表達 Leptin 組(0.91±0.04)較PBS 組(0.89±0.07)上調(diào)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.349，P＞0.05)，IL-8 的表達 Leptin 組(0.90±0.07)較PBS 組(0.14±0.03)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.239，P＜0.05)。

2.4 IL-8在Leptin促MCF-7細胞EMT過程中的作用 免疫熒光結(jié)果(圖5)顯示，相對于Leptin+IgG組，Leptin+anti-IL-8 組上皮相關(guān)分子 E-cadherin 相對熒光表達量由29.73±1.51 降低為6.29±0.54，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.23，P＜0.05)；間質(zhì)相關(guān)分子Vimentin 相對熒光表達量由 3.90±0.39 升高為 23.38±0.81，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=37.55，P＜0.05)。表明Leptin促MCF-7 細胞EMT 作用可被IL-8 的特異性抗體逆轉(zhuǎn)，即Leptin 主要通過促進MCF-7細胞分泌IL-8進而介導(dǎo)其EMT過程。

圖 4 Western blot 檢測 Leptin 對 MCF-7 細胞 p-AKT 的表達及IL-8 分泌的影響

圖5 Western blot檢測IL-8在Leptin促MCF-7細胞EMT過程中的作用(×400)

3 討論

EMT是上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的過程，參與胚胎發(fā)生、傷口愈合、組織再生等過程。近年來EMT在多種腫瘤包括乳腺癌的形成、發(fā)展中發(fā)揮的作用成為人們關(guān)注的熱點。發(fā)生EMT過程的細胞-細胞、細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用被重塑，導(dǎo)致上皮細胞之間以及上皮細胞與基底膜之間的黏附性降低，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移以及增加了腫瘤對臨床干預(yù)的耐受[15-17]。

Leptin 是一種脂肪組織分泌的激素，據(jù)文獻報道其可促進多種腫瘤細胞EMT 過程，包括乳腺癌。Leptin 所誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生發(fā)展是否與其促進EMT過程相關(guān)以及所涉及的中介分子和信號級聯(lián)機制有哪些成為近年來研究的熱點。研究表明腫瘤EMT 的發(fā)生依賴于腫瘤微環(huán)境中的各種可溶性生長因子、細胞因子或細胞外基質(zhì)成分等信號刺激，包括EGF、TGF-β、IL-6、IL-8 等因子，這些細胞因子在各類癌癥中均可促進EMT過程[13]。IL-8與腫瘤的生長、侵襲遷移密切相關(guān)，有報道乳腺癌患者血清IL-8水平與腫瘤進展和生存率降低呈正相關(guān)，然而機制尚不明確。本文以IL-8為切入點，研究Leptin對乳腺癌MCF-7細胞EMT過程的影響，以及探索其可能涉及的機制和信號通路。

本研究結(jié)果顯示，MCF-7 細胞中有Leptin 受體Ob-R 的表達。Leptin 能促進 MCF-7 的 EMT 過程，形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)細胞極性喪失、細胞間黏附性降低，細胞外基質(zhì)重組，由典型多邊形上皮細胞形態(tài)向梭形間充質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。同時上皮標志蛋白E-cadherin表達下降，間充質(zhì)標志蛋白Vimentin表達升高。據(jù)文獻報道，PI3K/AKT信號通路在Leptin的促腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7，18]，本研究結(jié)果顯示，和PBS組相比，Leptin顯著上調(diào)MCF-7細胞p-Akt的表達，促進MCF-7細胞IL-8 的分泌。為進一步探討IL-8 在Leptin 所介導(dǎo)的MCF-7細胞EMT過程中的作用，采用抗體封閉IL-8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCF-7 細胞上皮標志蛋白E-cadherin 和間充質(zhì)標志蛋白Vimentin表達逆轉(zhuǎn)，即Leptin對MCF-7細胞的促EMT作用與IL-8介導(dǎo)密切相關(guān)。

根據(jù)以上實驗結(jié)果，本研究初步斷定Leptin 能促進乳腺癌MCF-7 細胞的EMT 過程，并推斷其機制可能與Leptin激活PI3K/AKT信號通路上調(diào)IL-8的表達有關(guān)，為乳腺癌的生物治療提供了靶點及實驗依據(jù)。但是對于Leptin所誘導(dǎo)分泌的IL-8 對MCF-7 細胞的促EMT效應(yīng)是通過何種途徑實現(xiàn)的，其詳細作用機制如何，還有待進一步研究。