王林，樊清清，段雯婷，王維

1.西安市第一醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710002；2.西安市第一醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710002；3.西安市第一醫(yī)院心血管內科，陜西 西安 710002；4.西安市兒童醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710003

越來越多的流行病學證據(jù)表明，以脂肪堆積過多為特征性病變的肥胖，已經快速發(fā)展成全球性的健康問題[1]。肥胖不僅可以引起身體各種代謝并發(fā)癥，亦可增加患者罹患多種激素依賴性腫瘤的風險，同時顯著促進腫瘤的進展及不良預后過程，此現(xiàn)象在絕經后婦女乳腺癌患者的病例中尤為顯著[2-4]。眾所周知，細胞因子、炎性趨化因子和脂肪因子分泌失調所導致的脂肪細胞增生、肥大參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程。在眾多因子中，有致癌性的脂肪因子——瘦素(Leptin)，被認為是關聯(lián)肥胖和乳腺癌的一種最重要的分子中介。相比于正常乳腺上皮細胞，瘦素在乳腺腫瘤細胞中過表達[5-7]。另有研究表明，Leptin 受體(Ob-R)廣泛表達于人體內各種組織及腫瘤細胞上，Leptin 通過與腫瘤細胞上的Ob-R 結合可誘導其生存、遷移、侵襲等特性[8-9]。事實上除了研究Leptin 促進腫瘤細胞的發(fā)生和轉移過程，人們對于Leptin 在乳腺癌細胞上皮細胞間質化(EMT)過程中所發(fā)揮的作用較少研究。

EMT 是貼壁上皮樣細胞到間充質樣細胞表型轉換的過程，在胚胎形成、組織修復、傷口愈合以及各種病理情況如惡性腫瘤細胞的侵襲轉移中起重要作用。近期研究表明EMT 是多種癌癥進展中的一個重要的啟動因子，與腫瘤的轉移、復發(fā)以及不良預后關系緊密[7，10-12]。發(fā)生EMT 的細胞，其上皮細胞標志物鈣黏蛋白(E-cadherin)表達受抑制，間質細胞標志物如波形蛋白(Vimentin)表達升高。研究表明發(fā)生EMT的癌細胞可分泌多種細胞因子、生長因子和趨化因子，如白介素8(IL-8)[13]。IL-8是一種由巨噬細胞、上皮細胞等分泌的趨化因子，和包括乳腺癌在內的多種腫瘤細胞的增殖、血管形成、侵襲移擴散等過程密切相關[14]。

本研究以人乳腺癌MCF-7細胞為體外研究對象，分析Leptin 對其EMT 的作用并以趨化因子IL-8 為切入點探討其可能的分子途徑，為Leptin 參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制的闡明提供依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 材料 人MCF-7乳腺癌細胞株由西安市第一醫(yī)院檢驗科保存；Leptin 購買于Peprotech 公司；DMEM 培養(yǎng)基購買于Gibco 公司；胎牛血清購買于杭州四季青生物研究所；SDS-PAGE 蛋白緩沖液和封閉蛋白購買于武漢；蛋白Marker購買于北京賽百盛基因技術有限公司；細胞裂解液購買于碧云天生物研究所；HRP 發(fā)光試劑購買于Millipore公司；兔抗人Ob-R和IL-8 抗體購買于Santa Cruz 公司；兔抗人p-AKT、AKT 抗體購買于Cell Signaling 公司；兔抗人E-cadherin、Vimentin，鼠 抗 β-actin 抗 體 均 購 買 于Bioworld公司；二抗購于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7 細胞用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37℃、50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光法檢測MCF-7 細胞Leptin 受體Ob-R蛋白表達 取常規(guī)培養(yǎng)對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以3×105/孔的濃度于6孔板中培養(yǎng)，細胞加入兔抗人Ob-R(1:100)及FITC標記的二抗(羊抗兔IgG 1:1 000稀釋)，于熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)，其中細胞核經DAPI染色。

1.2.3 顯微鏡觀察Leptin 對MCF-7 細胞形態(tài)的影響 實驗分為對照組、Leptin 處理組，取對數(shù)期的MCF-7 細胞，經2.5 g/L 胰酶消化和磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用DMEM 培養(yǎng)液重懸，使細胞濃度為3×105/mL，按100 μL/孔的量加入 6 孔板中，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng) 16 h，細胞同步化后，經 3 遍 PBS 清洗后加入DMEM培養(yǎng)液，PBS組、Leptin組分別經PBS及100 ng/mL Leptin處理，作用48 h 后，于顯微鏡觀察MCF-7細胞形態(tài)。

1.2.4 Western blot 法檢測 Leptin 對 MCF-7 細胞EMT 相關蛋白 E-cadherin、Vimentin 表達的影響 實驗分組及處理同1.2.3，作用48 h 后，按試劑盒要求提取總蛋白，取120 μg 總蛋白行100 g/L SDS-PAGE，經干轉的PVDF膜以TBST(含50 g/L脫脂奶粉)4℃封閉4 h后加入兔抗人E-cadherin，Vimentin(1∶1 000)一抗于4℃孵育過夜，經2次TBST洗滌和1次TBS洗滌；加入二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000 稀釋)室溫孵育1 h，重復洗滌過程；滴加HRP 發(fā)光試劑，于暗室靜置2 min，應用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Quantity One4.6.6 軟件分析條帶光度值，檢測經Leptin 作用后MCF-7 細胞 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達變化，實驗重復3次。

1.2.5 Western blot 法檢測 Leptin 對 MCF-7 細胞IL-8 分泌及信號通路分子p-AKT 表達的影響 實驗分組、細胞處理及Western blot 檢測方法同上，其中一抗兔抗人 p-AKT、AKT，兔抗人 IL-8 按 1∶1 000 稀釋。檢測經Leptin作用后MCF-7細胞IL-8、p-AKT蛋白的表達變化，實驗重復3次。

1.2.6 免疫熒光法檢測IL-8 在Leptin 促MCF-7細胞EMT過程中的作用 實驗分為PBS組、Lepin組、Leptin+anti-IL-8組及Leptin+IgG組。后兩組在Leptin處理前1 h，分別加入IL-8 特異性抗體(1 μg/mL)及對照抗體IgG，孵育48 h，加入兔抗人E-cadherin、Vimentin (1∶100 稀釋)及 FITC 標記的二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000 稀釋)，于熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MCF-7 細胞Ob-R 的表達 免疫熒光檢測表明 MCF-7 細胞 Ob-R 有表達(圖 1)。

圖1 免疫熒光檢測MCF-7細胞上Ob-R的表達(×400)

圖2 顯微鏡觀察Leptin對MCF-7細胞EMT過程的影響(×200)

2.2 Leptin對MCF-7細胞EMT過程的影響 顯微鏡形態(tài)觀察(圖2)檢測表明Leptin能引起MCF-7細胞發(fā)生EMT改變，形態(tài)表現(xiàn)為極性消失，黏附性下降，細胞間連接變松散。Western blot法(圖3)檢測上皮標記物E-cadherin和間質標記物Vimentin蛋白的相對表達量，其中 E-cadherin 的表達 Leptin 組(0.14±0.04)較PBS 組(0.84±0.06)顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.033，P＜0.05)，Vimentin 的表達Leptin 組(1.04±0.14)較PBS 組(0.12±0.02)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.153，P＜0.05)。 以 上 結 果 均 表 明 Lepin 可 促 進MCF-7細胞上EMT過程。

圖3 Western blot檢測Leptin對MCF-7細胞EMT過程的影響

2.3 Leptin 促進 MCF-7 細胞 p-Akt 的表達及IL-8 的分泌 Western blot 法(圖 4)檢測 p-Akt、Akt、IL-8 蛋白的相對表達量，其中p-Akt 的表達Leptin 組(0.81±0.07)較PBS組(0.11±0.03)顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(t=15.566，P＜0.05)，Akt 的表達 Leptin 組(0.91±0.04)較PBS 組(0.89±0.07)上調，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.349，P＞0.05)，IL-8 的表達 Leptin 組(0.90±0.07)較PBS 組(0.14±0.03)顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.239，P＜0.05)。

2.4 IL-8在Leptin促MCF-7細胞EMT過程中的作用 免疫熒光結果(圖5)顯示，相對于Leptin+IgG組，Leptin+anti-IL-8 組上皮相關分子 E-cadherin 相對熒光表達量由29.73±1.51 降低為6.29±0.54，差異有統(tǒng)計學意義(t=25.23，P＜0.05)；間質相關分子Vimentin 相對熒光表達量由 3.90±0.39 升高為 23.38±0.81，差異有統(tǒng)計學意義(t=37.55，P＜0.05)。表明Leptin促MCF-7 細胞EMT 作用可被IL-8 的特異性抗體逆轉，即Leptin 主要通過促進MCF-7細胞分泌IL-8進而介導其EMT過程。

圖 4 Western blot 檢測 Leptin 對 MCF-7 細胞 p-AKT 的表達及IL-8 分泌的影響

圖5 Western blot檢測IL-8在Leptin促MCF-7細胞EMT過程中的作用(×400)

3 討論

EMT是上皮細胞轉化為間質細胞的過程，參與胚胎發(fā)生、傷口愈合、組織再生等過程。近年來EMT在多種腫瘤包括乳腺癌的形成、發(fā)展中發(fā)揮的作用成為人們關注的熱點。發(fā)生EMT過程的細胞-細胞、細胞-細胞外基質的相互作用被重塑，導致上皮細胞之間以及上皮細胞與基底膜之間的黏附性降低，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移以及增加了腫瘤對臨床干預的耐受[15-17]。

Leptin 是一種脂肪組織分泌的激素，據(jù)文獻報道其可促進多種腫瘤細胞EMT 過程，包括乳腺癌。Leptin 所誘導的乳腺癌發(fā)生發(fā)展是否與其促進EMT過程相關以及所涉及的中介分子和信號級聯(lián)機制有哪些成為近年來研究的熱點。研究表明腫瘤EMT 的發(fā)生依賴于腫瘤微環(huán)境中的各種可溶性生長因子、細胞因子或細胞外基質成分等信號刺激，包括EGF、TGF-β、IL-6、IL-8 等因子，這些細胞因子在各類癌癥中均可促進EMT過程[13]。IL-8與腫瘤的生長、侵襲遷移密切相關，有報道乳腺癌患者血清IL-8水平與腫瘤進展和生存率降低呈正相關，然而機制尚不明確。本文以IL-8為切入點，研究Leptin對乳腺癌MCF-7細胞EMT過程的影響，以及探索其可能涉及的機制和信號通路。

本研究結果顯示，MCF-7 細胞中有Leptin 受體Ob-R 的表達。Leptin 能促進 MCF-7 的 EMT 過程，形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)細胞極性喪失、細胞間黏附性降低，細胞外基質重組，由典型多邊形上皮細胞形態(tài)向梭形間充質細胞形態(tài)轉變。同時上皮標志蛋白E-cadherin表達下降，間充質標志蛋白Vimentin表達升高。據(jù)文獻報道，PI3K/AKT信號通路在Leptin的促腫瘤效應中發(fā)揮重要作用[7，18]，本研究結果顯示，和PBS組相比，Leptin顯著上調MCF-7細胞p-Akt的表達，促進MCF-7細胞IL-8 的分泌。為進一步探討IL-8 在Leptin 所介導的MCF-7細胞EMT過程中的作用，采用抗體封閉IL-8，結果發(fā)現(xiàn)MCF-7 細胞上皮標志蛋白E-cadherin 和間充質標志蛋白Vimentin表達逆轉，即Leptin對MCF-7細胞的促EMT作用與IL-8介導密切相關。

根據(jù)以上實驗結果，本研究初步斷定Leptin 能促進乳腺癌MCF-7 細胞的EMT 過程，并推斷其機制可能與Leptin激活PI3K/AKT信號通路上調IL-8的表達有關，為乳腺癌的生物治療提供了靶點及實驗依據(jù)。但是對于Leptin所誘導分泌的IL-8 對MCF-7 細胞的促EMT效應是通過何種途徑實現(xiàn)的，其詳細作用機制如何，還有待進一步研究。