肖宇 綜述 肖衛(wèi) 審校

長江大學附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 荊州 434000

肺部感染是臨床上的常見疾病，多發(fā)病，普遍見于各科室，且位于各類感染的首位，急性呼吸道感染造成的死亡人數(shù)為總疾病造成死亡數(shù)的第3 位，是嚴重威脅人類健康的疾病之一。病因中，大部分為病原體感染，也可因理化、免疫及藥物等因素引起。

細菌和真菌培養(yǎng)的是鑒定致病微生物的金標準方法。然而，通常需要2～3 d才能獲得結(jié)果，而且這種方法不適用于鑒定病毒。鑒定病毒通常使用聚合酶鏈反應或抗原檢測，但只能檢測有懷疑方向的病毒。此外，病毒分離也是確定致病病原體的可靠方法，但是耗時，并且其敏感性可能不夠。雖然進行了這些檢測方法，但仍有13%～62%的成人肺炎患者中未發(fā)現(xiàn)明顯的病原體[1-2]。

高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing)一次可以對數(shù)十萬到數(shù)百萬的DNA 或RNA 分子進行測序，該技術(shù)使得檢測速度極大加快。同時相比于第一、二代測序技術(shù)，核酸測序的單堿基成本大幅下降，因此又被稱為“下一代”測序技術(shù)(“next-generation”sequencing technology，NGS)。不同于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，其通過直接對臨床樣本中的核酸進行檢測，然后再與數(shù)據(jù)庫比對分析，最后依據(jù)比對到的序列信息可判斷樣本包含的病原體種類。通過該技術(shù)，可快速、客觀地檢測送檢標本中所包含的病原微生物(細菌、真菌、病毒、寄生蟲等)，而且無需費時的進行特異性擴增，對于急危重癥和疑難感染的診斷尤其適用[3]。

自2014 年NGS 首次被報道應用于聯(lián)合免疫缺陷綜合征合并感染的一位患者，并在尋找病原體中起到關(guān)鍵性作用[4]，到2016年美國FDA正式的認可NGS技術(shù)。近年來已越來越多的應用于肺部感染性疾病病原菌的診斷[5]，并對細菌在疾病發(fā)展中作用的理解得到了更近一步加強。

1 在肺部微生物群落檢測中的應用

在過去的幾十年中，人們一直認為隆凸以下的肺部是無菌的，但近年來NGS 的不斷應用，已證實肺部并不是無菌的，有大量厭氧菌和好氧菌定植。HILTY等[6]使用基因測序技術(shù)對下呼吸道中存在的重要微生物群進行了報告，比較了哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)受試者和健康對照組中三種不同人類棲息地的微生物群。他們比較了通過表面拭子取樣的鼻腔和口咽微生物群，以及通過支氣管刷取左肺上葉黏膜表面取樣的下呼吸道微生物群。在8名對照受試者的氣道刷檢中，鑒定出了幾個不同的細菌門。此外，在健康對照組、哮喘組和慢性阻塞性肺疾病組的受試者中，微生物群落的豐度相似，但細菌群落組成有顯著差異。

對正常成人肺部標本進行16S rRNA測序鑒定提示，肺部的常見細菌種群為變形桿菌、厚壁菌門和擬桿菌門，而在屬的水平上，鏈球菌、普雷沃氏菌和韋氏菌占優(yōu)勢，嗜血桿菌和奈瑟氏菌較小[7-8]。然而，與上呼吸道的菌群數(shù)量相比，它相對稀疏。據(jù)報道，支氣管的群落組成與上呼吸道相似，但生物量較少。該結(jié)果表明肺微生物組的來源可能是從上呼吸道吸入的[9]。

而且肺部支氣管黏膜上的細菌定植并也不是單一的菌群，不同的呼吸系統(tǒng)疾病狀態(tài)下的呼吸道菌群組成也并不相同，肺部感染并不是病原微生物對無菌空間的侵襲，而是微生物豐度的發(fā)生了變化。對于傳統(tǒng)技術(shù)檢測，如果在呼吸道標本中發(fā)現(xiàn)有口咽部常見細菌，那么將不能除外為口咽部污染所致。而對于NGS檢測可通過其相對豐度的變化進行進一步的判別。

通過對確診為支氣管擴張患者的測序分析顯示，該類患者的肺部細菌群落主要為假單胞菌屬、嗜血桿菌屬和鏈球菌屬，且假單胞菌和嗜血桿菌占優(yōu)勢的微生物群已被證明與嚴重疾病和頻繁惡化有關(guān)[10]。該結(jié)果支持了培養(yǎng)報告中的發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢微生物，但同時表現(xiàn)出個體內(nèi)穩(wěn)定性和較大的個體間變異性。

在穩(wěn)定的慢性阻塞性肺病中，其中微生物密度從上呼吸道到下呼吸道呈梯度下降，其中來自上氣道的吸入被認為是主要來源[11]。GALIANA等[12]發(fā)現(xiàn)，與輕度或中度氣流阻塞的患者相比，嚴重氣流阻塞的患者在痰樣本中表現(xiàn)出較低的菌群多樣性和較高的細菌載量。這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在痰和支氣管肺泡灌洗取樣中重現(xiàn)[13]。這些研究還報道了肺功能下降的微生物菌群向潛在致病細菌屬的轉(zhuǎn)變，特別是屬于如假單胞菌屬或嗜血桿菌屬的細菌。

迄今為止，通過NGS 檢測，人們已認識到健康人群肺部并非無菌，且證明了健康人群和肺疾病人群之間肺部微生物群落的差異，并也了解到了肺內(nèi)微生物菌群失調(diào)與肺部疾病之間的關(guān)聯(lián)。

2 在重癥感染患者的應用

NGS 有能無偏性的病原體覆蓋檢測，靈敏度高；并且可以明確病原體的種類和分型，還可提供耐藥基因和毒力因子的分析。在臨床實際應用中，對患者的抗菌藥物選擇和治療效果評價具有一定的指導意義，是明確感染性疾病病原菌的有效手段[14]，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷。有研究表明對重癥感染病人的血標本進行高通量測序檢測與細菌培養(yǎng)進行比較，整體診斷敏感性由單純細菌培養(yǎng)的12.82%顯著提高至單純 NGS 的 30.77%[15]。XIE 等[16]對上海交通大學醫(yī)學院附屬上?？傖t(yī)院重癥醫(yī)學科的178例重癥肺炎患者進行回顧性分析提示，在重癥肺部感染患者中應用NGS 能夠早期明確致病菌，并指導抗菌藥物選擇和治療，最終降低死亡率。相較于常規(guī)微生物學檢測，NGS在檢測致病菌方面顯示出顯著更高的陽性率(68.7%vs 45.4%)。

2018年的一項回顧性研究也表明，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)，NGS具有更高的敏感性。同時在對結(jié)核、真菌、病毒和厭氧菌感染的診斷方面有更大的優(yōu)勢[17]。而且在抗菌藥物使用的影響方面NGS也小于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，并且可以依據(jù)檢測報告來進行抗菌藥物治療方案的調(diào)整。

3 在特殊類型感染患者中的應用

對于免疫缺陷患者、傳統(tǒng)檢測結(jié)果陰性且治療效果不佳的感染患者和反復多次住院治療的患者，其感染灶的致病微生物復雜，通常不同于正常人群的致病菌。其致病菌可能為機會性致病菌或攜帶多重抗生素耐藥基因的病原體[18]。對比于傳統(tǒng)檢測方法，NGS是更好的輔助檢測手段[19-20]。

PAN等[21]在一項對免疫功能低下合并社區(qū)獲得性肺部感染的研究中顯示，在病毒和真菌方面的檢測上NGS有著明顯優(yōu)勢，而且對于混合感染方面也優(yōu)于傳統(tǒng)檢測手段。2019年有報道在1例血功能衰竭反復因肺部感染住院治療患者中利用NGS檢測肺泡灌洗液，證實為肺孢子蟲感染[22]。GU 等[23]報道了5 例抗感染治療效果不佳，經(jīng)過對支氣管肺泡灌洗液和肺組織進行NGS 檢測，最終確診為鸚鵡熱衣原體，并針對性調(diào)整抗菌藥物治療后病情好轉(zhuǎn)。LANGELIER 等[24]對由于呼吸道感染入院的骨髓移植患者，運用NGS檢測患者的肺泡灌洗液樣本，結(jié)果證實呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在HRV-A、HHV-6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及扭矩特諾病毒等多種病毒，以及存在少見的致病性細菌如輕型鏈球菌及棒狀桿菌。有研究表示，在免疫缺陷合并感染患者的致病菌診斷方面，NGS檢測有著重要的作用[25]。并且對于該類患者NGS在細菌和病毒感染的診斷方面，陽性率是傳統(tǒng)檢測方法的3 倍以上。

對于結(jié)核感染，華山醫(yī)院的周晛等[26]排除活動性結(jié)核感染患者，NGS 均未檢出結(jié)核序列，特異度為100%。但對9 例確診活動性結(jié)核患者和10 例臨床診斷為活動性結(jié)核病患者進行NGS 檢測，敏感度為57.9%。對同一患者的標本同時送檢Xpert MTB/RIF與NGS，提示NGS 和Xpert MTB/RIF 兩者的敏感度、特異度并無統(tǒng)計學差異。

4 結(jié)果判讀

常見的結(jié)果指標有檢出序列數(shù)、深度、離散度、基因組覆蓋度和微生物豐度。在結(jié)果中某病原體的檢出序列數(shù)、深度、離散度和基因組覆蓋度越高，表示檢測到該微生物的可靠性越高[3]。SIMNER等[27]認為，對于檢測細菌、真菌和寄生蟲的陽性判斷，為每百萬映射讀取的序列數(shù)≥陰性對照的10 倍；病毒的序列數(shù)≥20，同時要求覆蓋度＞2%。

復旦大學附屬中山醫(yī)院的研究團隊[17]定義的判斷標準為，細菌(不包括分枝桿菌)、病毒和寄生蟲其覆蓋率比任何其他微生物高10倍；真菌覆蓋率比任何其他微生物組高5倍。對于結(jié)核分枝桿菌如檢測出唯一比對序列即作為陽性判斷，但非結(jié)核分枝桿菌需排在所有微生物的前10名。

目前對NGS的報告解讀未有統(tǒng)一的標準[14]，需結(jié)合臨床特征綜合判斷。更精確有效的判斷方法需要更深一步的研究證實。

5 結(jié)語

NGS 相對于病原學檢測方法(如微生物培養(yǎng)技術(shù)、核酸擴增技術(shù)、血清學病原菌抗體檢測技術(shù)及特定病原菌的多重PCR 技術(shù)等)，有檢測范圍廣、檢測種類多，無須培養(yǎng)、不受抗生素影響的優(yōu)點，并能同時明確樣本中的細菌、真菌、病毒及原蟲，并且能夠精確到種水平，還能夠明確微生物的抗生素耐藥等功能；且了解肺部菌群和呼吸道疾病的關(guān)聯(lián)有一定意義。

對于胞內(nèi)感染菌檢測，如軍團菌、結(jié)核分枝桿菌等，因其在胞外的含量較低，故而檢測的敏感性偏低[26]。但隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化，NGS 對胞內(nèi)感染菌診斷的敏感性會逐漸增高。而且其結(jié)果判讀目前并無統(tǒng)一標準，需要臨床醫(yī)生結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、采集樣本類型、微生物背景、傳統(tǒng)的病原體檢測報告和輔助檢查等判斷是定植菌、背景菌還是致病菌。

總之，經(jīng)過近些年來NGS 的不斷應用，醫(yī)學界進一步的認識了肺部的微環(huán)境，同時對肺部菌群和肺部疾病的關(guān)系有了新的見解。同時NGS 技術(shù)這一種新的檢測手段，補充了臨床上對不明原因感染、危重癥及免疫低下患者的病原學檢測方案，提高病原體的檢出率，對幫助臨床醫(yī)生精準診療、減少廣譜抗生素的經(jīng)驗性使用、降低重癥患者死亡率有一定意義。