陸偲倩,張景皓,黃天雄,趙 虎,楊 峰,賈 楠,杜一平*

(1.上海功能性材料化學(xué)重點實驗室，華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237;2.復(fù)旦大學(xué) 附屬華東醫(yī)院 檢驗科，上海 200040)

嗜麥芽窄食單胞菌是一種新型的條件致病菌，其外膜通透性較低，且可生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，故對氨基糖苷或β-內(nèi)酰胺等多種抗生素具有抗性[1-2]。近年來，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的濫用以及侵入性醫(yī)療操作過程的增加，嗜麥芽窄食單胞菌已經(jīng)成為臨床上令人極其頭疼的耐藥致病菌之一。嗜麥芽窄食單胞菌的感染部位多種多樣，包括下呼吸道感染、血流感染、尿路感染、皮膚軟組織感染、心內(nèi)膜炎以及各種術(shù)后造成的器官炎癥感染[3-7]。其中，血流感染是最常見的一種。目前，血流感染的檢測手段層出不窮，有傳統(tǒng)的血培養(yǎng)法(包括衍生出的自動血培養(yǎng)檢測系統(tǒng))[8]；有特異性強的生物標志物檢測技術(shù)，如以白細胞介素6(IL-6)、內(nèi)毒素等為特征媒介來檢測致病菌的陽性率[9]；還有新興的分子生物學(xué)技術(shù)，如目前運用廣泛的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)[10]。但血培養(yǎng)技術(shù)耗時長、靈敏度低，生物標志物技術(shù)應(yīng)用范圍狹窄，分子生物學(xué)技術(shù)所需儀器和試劑成本昂貴，操作繁瑣，且可能存在一定的假陽性結(jié)果[11]。因此，亟需開發(fā)一種快速、簡便且經(jīng)濟的檢測方法來及時診斷和控制嗜麥芽窄食單胞菌的感染，并預(yù)防其進一步擴散。

表面增強拉曼散射(SERS)是一種高靈敏度、快速、無損、低成本的振動光譜檢測技術(shù)，其利用貴金屬納米顆粒作為基底，并以無標記的方式將細菌細胞吸附到貴金屬顆粒之間的“熱點”表面[12]。由于貴金屬納米顆粒粗糙表面所產(chǎn)生的電磁場以及金屬顆粒與所吸附物質(zhì)之間的電荷轉(zhuǎn)移作用，使得入射光的信號被特異性增強，從而輻射出“尖峰”狀的拉曼散射信號[13]。大量文獻表明，SERS被廣泛用于腸道細菌鑒定、尿路感染檢測和血清中細菌分類等研究，是研究帶發(fā)色團的蛋白質(zhì)和核酸的有力工具[11-12]。SERS的基底對檢測結(jié)果的影響巨大，理想的基底需具有高靈敏度、均勻性好、再現(xiàn)性高(RSD(相對標準偏差)≤20%)、背景信號低等特性[14]。SERS基底的制備方法眾多，其中通過化學(xué)還原法制備納米顆粒溶膠是最常用的方法之一，但由于納米顆粒之間的團聚，其使用壽命一般都很短。Chen等[15]通過一步法快速合成了銀溶膠，避免了溶膠壽命短的缺陷，其即制即用的特點能夠在現(xiàn)場檢測中發(fā)揮巨大作用。本文將經(jīng)過改進的一步法制備的銀溶膠應(yīng)用于嗜麥芽窄食單胞菌的快速檢測，展示出良好的應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 試劑、樣品與儀器

抗壞血酸、色氨酸、酪氨酸(上海笛柏生物科技有限公司)，檸檬酸三鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，硝酸銀(上海泰坦科技股份有限公司)，羅丹明6G(R6G，阿拉丁試劑公司)，苯丙氨酸(上海麥克林生化科技有限公司)，氯化鈉、腺嘌呤、胞嘧啶(上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)，鳥嘌呤(上海畢得醫(yī)藥科技有限公司)，胸腺嘧啶(南京健友生物化學(xué)有限公司)。上述試劑均為分析純。

嗜麥芽窄食單胞菌標準菌株ATCC17666 1株由上海市臨檢中心提供，臨床分離菌株10株由復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院提供，于2019年1月至3月期間收集，分離自華東醫(yī)院門診部及住院患者的感染體液樣本。4例經(jīng)過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)菌種驗證的陽性病人血液樣本和2例陰性血液樣本由華東醫(yī)院收集并提供。

VERSA TREK血培養(yǎng)系統(tǒng)(美國賽默飛公司)，配有需氧瓶和厭氧瓶；VITEK MS基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司)，配備48孔靶板；哥倫比亞血瓊脂平板(上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司)，普通分離膠促凝管(美國BD公司)。i-Raman拉曼光譜儀(美國B&W Tek 公司)，配有二極管激光器(激發(fā)波長為785 nm，最大激發(fā)功率為300 mW)以及拉曼顯微檢測平臺( 20×物鏡)，分辨率5 cm-1，掃描范圍175～3 200 cm-1。高速離心機(上海力辰邦西儀器科技有限公司)；S-3400N掃描電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 銀溶膠基底的制備

通過改進的文獻[15]方法制備銀溶膠：將抗壞血酸和檸檬酸三鈉分別作為還原劑和穩(wěn)定劑，還原硝酸銀溶液制備銀溶膠。為得到性能更好、更穩(wěn)定的銀溶膠，用50 ℃ 水浴法代替手握法進行加熱。稱取0.010 6 g抗壞血酸和0.058 8 g檸檬酸三鈉定容于100 mL容量瓶中，并立刻取5 mL加入到10 mL 玻璃小瓶中(內(nèi)徑18.4 mm，高度65 mm)，將玻璃小瓶置于50 ℃ 水浴鍋中，攪拌加熱，并向玻璃瓶內(nèi)加入0.05 mL 0.1mol/L的AgNO3溶液，在不到10 min內(nèi)，即可得到灰綠色的銀溶膠，冷卻至常溫，避光保存以備下一步使用。

1.3 嗜麥芽窄食單胞菌菌懸液的制備

將嗜麥芽窄食單胞菌接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，并置于5% CO2、35 ℃孵育箱中培養(yǎng)18～24 h。選取單個菌落，采用VITEK MS質(zhì)譜儀及配套試劑進行菌種鑒定，操作嚴格按照基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜儀微生物鑒定操作標準進行[16]。將嗜麥芽窄食單胞菌標準菌株ATCC17666和10株臨床菌株分別用DD H2O(無菌水)配制成濃度為1×108菌落形成單位(Colony forming unit,CFU)/mL的菌懸液，置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.4 人體血流感染陽性樣本中嗜麥芽窄食單胞菌的提取

將4例放置于5% CO2、35 ℃ 孵育箱中的陽性報警病人的血液樣本取出，移取2.5 mL血液至5 mL普通分離膠促凝管中，以3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入500 μL蒸餾水將分離膠上粘附的嗜麥芽菌體洗脫，并將充分混合的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，以17 000 r/min離心2 min，棄去上清液，再加入500 μL蒸餾水重懸，離心2 min。重復(fù)上述步驟3次，最后加入200 μL蒸餾水定容備用。2例陰性血液樣本按照上述操作后，作為空白對照組。最終的光譜檢測過程與純培養(yǎng)菌懸液的檢測過程一致。

1.5 SERS光譜檢測

取50 μL銀溶膠加入2 mL離心管中，再分別加入50 μL菌懸液和25 μL 1%的NaCl溶液，振蕩混合，取混合溶液50 μL于鋁板上，待混合液滴自然干燥后，以100%的激光功率和10 s的積分時間進行SERS檢測，每個樣本采集5次。所有的原始數(shù)據(jù)使用BWSpec 4.03_24_C 2015光譜軟件包進行平滑、基線校正和平均化。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀溶膠的表征

2.1.1 銀溶膠的粒徑分布及與細菌的表面作用利用掃描電子顯微鏡(SEM)對銀溶膠的粒徑以及細菌與銀溶膠作用后的表面形貌進行表征，結(jié)果如圖1所示。銀溶膠的粒徑分布約在70～80 nm(圖1A)，納米粒子之間存在一定程度的團聚，有利于“熱點”的產(chǎn)生和相應(yīng)SERS信號的收集。圖1B中，細菌的細胞個體呈長1.5～2 μm，寬0.5 μm的短桿狀。由插圖的局部狀態(tài)可知，菌體上方及周圍分布著大量銀納米顆粒，使得其表面較為粗糙不平整。

圖1 銀溶膠(A，×1 μm)及細菌與銀溶膠混合溶液(B，×20 μm)的SEM形貌圖

2.1.2 銀溶膠的SERS性能使用羅丹明6G(R6G)作為表征一步法銀溶膠SERS性能的探針，向銀溶膠中加入不同濃度的R6G后，得到的SERS光譜圖如圖2所示。結(jié)果表明，一步法制備的銀溶膠具有良好的SERS增強性能，能夠檢測到明顯SERS信號的R6G探針的濃度低至1.0×10-9mol/L。

圖2 一步法銀溶膠中加入不同濃度的R6G后的SERS光譜圖

2.2 嗜麥芽菌的SERS譜圖分析

為了探究嗜麥芽窄食單胞菌的生物結(jié)構(gòu)信息，對其標準菌株(圖3A)和臨床菌株(圖3B)分別進行SERS光譜檢測，得到特征指紋譜圖。由圖可見，10個臨床樣本的譜峰一致性較高，且與標準菌株的譜圖非常接近，反映了嗜麥芽窄食單胞菌表面蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等的物質(zhì)信息。由于病人體液環(huán)境不同，分離得到的菌株間存在一定差異，使得特征峰的拉曼位移出現(xiàn)小范圍的波動。其中，730/732、959、1 049/1 051、1 331/1 332 cm-1處產(chǎn)生的高強度、尖銳的拉曼譜峰，可作為后續(xù)方法學(xué)驗證的指示波段。

分別制備了濃度為0.01 mol/L的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3種會產(chǎn)生特征SERS信號的氨基酸溶液以及腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶4種DNA堿基溶液作為細菌生物信息譜峰歸屬的確證標志物，最終得到對比譜圖如圖3C和圖3D所示，結(jié)果與參考文獻所記錄的光譜信號基本一致[17-19]。

由圖3C可知，839、878、1 549 cm-1處的拉曼譜峰對應(yīng)于色氨酸，896、1 137 cm-1處對應(yīng)于酪氨酸，而1 053 cm-1處則是3種氨基酸的共有峰，對應(yīng)C—C骨架呼吸振動。1 206、1 246 cm-1處的拉曼譜峰分別對應(yīng)于酪氨酸和苯丙氨酸，通過查閱文獻，推測這兩處峰反映了酰胺Ⅲ帶的信號[19]。圖3D中，628、734和1 333 cm-1處的拉曼譜峰對應(yīng)于腺嘌呤，1 139、1 635 cm-1處的譜峰對應(yīng)于胞嘧啶，660 cm-1處的譜峰則包含了鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶3種堿基的結(jié)構(gòu)信息。至于957 cm-1和1 053 cm-1處的譜峰，則是DNA堿基的共有峰。其中957 cm-1對應(yīng)于堿基的脫氧核糖，1 053 cm-1對應(yīng)于堿基的C—C骨架呼吸振動。1 373 cm-1處的微弱峰反映了堿基(T/A/G)的鏈振轉(zhuǎn)狀態(tài)。此外，指紋譜圖上還有一些糖類和脂質(zhì)的信息，但是與它們相關(guān)的特征峰信號并沒有氨基酸和堿基那么強，根據(jù)文獻[20-23]對其分別進行歸屬，18組拉曼特征峰的歸屬結(jié)果如表1所示。

圖3 嗜麥芽窄食單胞菌的SERS譜圖

表1 嗜麥芽窄食單胞菌SERS譜峰歸屬表

圖4 嗜麥芽窄食單胞菌標準菌株在不同濃度下的SERS譜圖

圖5 一步法銀溶膠檢測嗜麥芽窄食單胞菌方法重現(xiàn)性結(jié)果圖

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 靈敏度在臨床患者的體液樣本中，致病的嗜麥芽窄食單胞菌的濃度往往較低。通過采集標準菌株在不同濃度下的SERS信號發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌液的濃度下降至5×106CFU/mL時，可以觀察到730、1 051 cm-1處的特征譜峰；而當(dāng)濃度進一步下降至2×106CFU/mL時，只有1 051 cm-1處有極其微弱的光譜信號(圖4)。因此認為，該方法所檢測到的致病菌最低濃度為5×106CFU/mL。常用的病原體檢測技術(shù)，如MALDI-TOF要求的最低檢測濃度為105～106CFU/mL，甚至是107CFU/mL[24]。文獻中也曾明確提到[25]，只有在濃度≥105CFU/mL時，才能保證可靠的鑒定結(jié)果。因此，本方法基本能滿足臨床需要。

2.3.2 重現(xiàn)性在相同條件下制備了3批銀溶膠基底，選擇5株嗜麥芽窄食單胞菌臨床樣本作為檢測對象，在相同儀器參數(shù)設(shè)置下采集拉曼信號，并將上述4組峰信號較強的特征峰730、959、1 051、1 333 cm-1作為指示峰，以評估重現(xiàn)性。結(jié)果如圖5所示，其相對標準偏差(RSD)為6.8%～16%，基本滿足實際分析的要求。

2.3.3 與傳統(tǒng)銀溶膠的比較本研究將采用傳統(tǒng)方法——檸檬酸還原法[26]制備的銀溶膠作為比較對象，得到的光譜對比圖如圖6所示。實驗結(jié)果表明，傳統(tǒng)法制備的銀溶膠的SERS增強效果略優(yōu)于一步法銀溶膠，但是這兩種基底所形成的嗜麥芽窄食單胞菌的光譜形狀基本相同，且特征峰的相對強度差距不大。然而，一步法具有制備速度快、操作簡單等獨特優(yōu)勢，整個過程僅需10 min，傳統(tǒng)的還原法則需60 min左右。因此，一步法銀溶膠基底對臨床的快速診斷具有更大的應(yīng)用價值。

2.4 陽性血液樣本中嗜麥芽窄食單胞菌的檢測

采用4例陽性病人和2例陰性病人血液樣本，進一步驗證本文方法在臨床檢測上的可行性。如圖7所示，從陽性血液樣本中提取到的細菌展示出與純培養(yǎng)菌株非常相似的拉曼信號，特別是在730、959、1 331 cm-1處，說明4個陽性樣本的譜峰基本與純培養(yǎng)菌株相吻合，陰性樣本則沒有明顯的拉曼特征信號。

圖7 陽性血液樣本的SERS光譜圖

圖6 嗜麥芽窄食單胞菌用一步法銀溶膠與傳統(tǒng)法銀溶膠測試的SERS光譜對比圖

3 結(jié) 論

本研究利用一步法快速合成的銀溶膠為基底，對臨床上常見的條件致病菌嗜麥芽窄食單胞菌進行SERS檢測，得到的陽性血樣中嗜麥芽窄食單胞菌的拉曼譜圖與純培養(yǎng)菌株相似，證明本方法有望作為檢測病人體液中致病菌的臨床手段。本方法耗時短、操作簡便、儀器便攜且成本較低，在醫(yī)院及檢驗檢疫中心進行現(xiàn)場快速診斷方面具有應(yīng)用推廣價值。