白 月 李雅楠 袁 煒 牛敏霞 劉文康 黃懷鵬

(河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2019級(jí)碩士研究生，河北 石家莊 050200)

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)主要是由血管狹窄、粥樣硬化或者梗死造成心臟局部血供減少、心肌損傷的一組疾病，包括冠心病、心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合征等[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活條件的改善，我國IHD的患病率和死亡率持續(xù)上升。最新調(diào)查結(jié)果顯示，2018年我國冠心病患者約為1100萬，其中每10萬患者就有156.73人死亡[2]。IHD已成為嚴(yán)重威脅我國國民健康的主要疾病之一[3]。

中醫(yī)學(xué)將IHD歸于“胸痹”“真心痛”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣虛血瘀是胸痹、真心痛的重要病機(jī)，氣虛則無力推動(dòng)血行而致瘀，血瘀又會(huì)進(jìn)一步加重氣虛，形成惡性循環(huán)[4]。血液流變學(xué)異常亦是胸痹發(fā)生、發(fā)展的重要原因[5]。缺血、缺氧或腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成酶功能障礙會(huì)導(dǎo)致氣虛，進(jìn)而引起血液循環(huán)功能障礙，最終導(dǎo)致血液流變學(xué)異常。中醫(yī)藥在治療IHD方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。尚云用黃芪湯加減化裁治療冠心病無癥狀性心肌缺血、穩(wěn)定型心絞痛等多種心臟疾病療效顯著[6]。邸海俠等[7]通過對(duì)147首治療心肌缺血的方劑進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，黃芪的使用頻次位居第二。黃芪被譽(yù)為“補(bǔ)藥之長”，具有補(bǔ)氣活血的功效。近年來，黃芪復(fù)方及單體成分在IHD方面的應(yīng)用和療效備受關(guān)注。以黃芪為君藥的中藥復(fù)方制劑芪參益氣滴丸可通過調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路來調(diào)節(jié)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)氧氣的感知和反應(yīng)，從而對(duì)缺血心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[8]。復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑可改善氣虛血瘀型冠心病不穩(wěn)定性心絞痛患者的臨床癥狀及中醫(yī)證候積分[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪含有黃酮類、皂苷類、多糖類等多種有效成分，其中黃芪甲苷為黃芪的皂苷成分，對(duì)大鼠缺血心肌具有保護(hù)作用[10-11]。黃芪甲苷葡萄糖注射液是以黃芪甲苷為主要成分制成的無菌注射液。本實(shí)驗(yàn)旨在建立多種心肌缺血損傷動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)黃芪甲苷葡萄糖注射液抗心肌缺血損傷的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠110只，6周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0020。SPF級(jí)SD大鼠160只，8周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于溫度(23±1)℃、濕度(35±5)%、12 h明暗交替的環(huán)境，自由飲水進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院附屬石家莊平安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(批號(hào)：20200805)，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.1.2 藥品與試劑 黃芪甲苷葡萄糖注射液，由山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司現(xiàn)代中藥研究室提供，規(guī)格：20 mg/100 mL，批號(hào)：051001；鹽酸維拉帕米注射液(哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H23020958，規(guī)格：2 mL/5 mg，批號(hào)：180921)；硝酸異山梨酯注射液(齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10960035，規(guī)格：10 mL/10 mg，批號(hào)：04110382)；水合氯醛(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20150622)；鹽酸異丙腎上腺素(ISO，山東科源制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H37022268，批號(hào)：101443898)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 美國BIC 16導(dǎo)生理記錄儀(美國BIC公司)，血液流變學(xué)測試儀(型號(hào)：E3-9XW，成都麥賽科貿(mào)有限公司)，單道心電圖機(jī)(型號(hào)：FX-2111，北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司)，多導(dǎo)同步心外膜電圖系統(tǒng)(型號(hào)：ALC-EECG，上海奧爾科特生物科技有限公司)，電子秒表。

1.2 方法

1.2.1 耐缺氧實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即溶媒組、維拉帕米組(2 mg/kg)及黃芪甲苷葡萄糖注射液高劑量組(以下簡稱高劑量組，8 mg/kg)、黃芪甲苷葡萄糖注射液中劑量組(以下簡稱中劑量組，4 mg/kg)和黃芪甲苷葡萄糖注射液低劑量組(以下簡稱低劑量組，2 mg/kg)，每組各10只。各組分別予尾靜脈注射相應(yīng)藥液(溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，10 min后將各組小鼠放入底部有鈉石灰的廣口瓶(規(guī)格：125 mL，鈉石灰5 g，用于吸收CO2和水)中，密閉(用凡士林涂抹瓶口防止漏氣)，以小鼠腹部無起伏為觀察截點(diǎn)，用電子秒表記錄小鼠從廣口瓶密閉到停止呼吸的時(shí)間。

1.2.1.2 心肌缺血小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn) 取小鼠60只，隨機(jī)分為6組，即正常組、溶媒組、維拉帕米組(2 mg/kg)、高劑量組(8 mg/kg)、中劑量組(4 mg/kg)和低劑量組(2 mg/kg)，每組各10只。各組分別予尾靜脈注射相應(yīng)藥液(正常組、溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，10 min后，除正常組外，其余5組小鼠參照文獻(xiàn)[12]予ISO 10 mg/kg皮下注射誘導(dǎo)心肌缺血，15 min后將6組小鼠均放入底部有鈉石灰的廣口瓶(規(guī)格：125 mL，鈉石灰5 g)中，用凡士林涂抹瓶口密閉，以小鼠腹部無起伏為觀察截點(diǎn)，用電子秒表記錄小鼠從廣口瓶密閉到停止呼吸的時(shí)間。

1.2.1.3 氣管夾閉心電消失實(shí)驗(yàn) 取大鼠50只，隨機(jī)分為5組，即溶媒組、維拉帕米組(1 mg/kg)、高劑量組(4 mg/kg)、中劑量組(2 mg/kg)和低劑量組(1 mg/kg)，每組各10只。各組大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰位，固定，頸部正中切口，分離氣管，分別尾靜脈注射相應(yīng)藥液(溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，10 min后夾閉大鼠氣管，開始計(jì)時(shí)，連接心電圖Ⅱ?qū)?lián)，至心電圖Ⅱ?qū)?lián)持續(xù)出現(xiàn)一平直線記為大鼠心電消失時(shí)間。

1.2.2 抗心肌缺血損傷實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 心電ST段總偏移實(shí)驗(yàn) 取大鼠50只，隨機(jī)分為5組，即溶媒組、硝酸異山梨酯組(2 mg/kg)、高劑量組(4 mg/kg)、中劑量組(2 mg/kg)和低劑量組(1 mg/kg)，每組各10只。各組大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，記錄正常心電圖后，分別尾靜脈注射相應(yīng)藥液(溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，給藥10 min后予ISO 6 mg/kg皮下注射，記錄ISO皮下注射后1、5、10、15 min的Ⅱ?qū)?lián)心電圖，測量各時(shí)間點(diǎn)心電圖的ST段偏移，以1、5、10、15 min的ST段偏移之和作為總ST段偏移幅度(∑ST)。

1.2.2.2 血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn) 取大鼠60只，隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、溶媒組、硝酸異山梨酯組(2 mg/kg)、高劑量組(4 mg/kg)、中劑量組(2 mg/kg)和低劑量組(1 mg/kg)，每組各10只。各組大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，連接生理記錄儀，自大鼠左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐及左心房間找出冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，除假手術(shù)組外，其余5組在距起點(diǎn)2～3 mm處用6-0帶線縫合針進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎后肉眼可見心尖由紅變白，心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段抬高、T波倒置(見圖1)，提示心肌缺血模型建立成功，將心臟送回胸腔，擠出胸腔內(nèi)血液和氣體，立即縫合胸壁。假手術(shù)組不進(jìn)行結(jié)扎，其余步驟同其余5組。各組分別連續(xù)尾靜脈注射相應(yīng)藥液(假手術(shù)組、溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)3 d，末次給藥60 min后，均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 mL(麻醉、采血前16 h禁食不禁水)， 50 U肝素抗凝，用血液流變學(xué)測試儀測定全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細(xì)胞比容。

圖1 心肌缺血大鼠造模前后心電圖

2 結(jié)果

2.1 常壓缺氧實(shí)驗(yàn)各組小鼠呼吸時(shí)間比較 見表1。

表1 常壓缺氧實(shí)驗(yàn)各組小鼠呼吸時(shí)間比較

由表1可見，與溶媒組比較，維拉帕米組、高劑量組及中劑量組小鼠呼吸時(shí)間均顯著延長(P<0.05)。維拉帕米組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 心肌缺血小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn)各組小鼠呼吸時(shí)間比較 見表2。

表2 心肌缺血小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn)各組小鼠呼吸時(shí)間比較

由表2可見，與正常組比較，溶媒組和低劑量組小鼠呼吸時(shí)間縮短(P<0.05)。與溶媒組比較，維拉帕米組、高劑量組及中劑量組小鼠呼吸時(shí)間均顯著延長(P<0.05)。維拉帕米組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 氣管夾閉心電消失實(shí)驗(yàn)各組大鼠心電消失時(shí)間比較 見表3。

表3 氣管夾閉心電消失實(shí)驗(yàn)各組大鼠心電消失時(shí)間比較

由表3可見，與溶媒組比較，維拉帕米組、高劑量組及中劑量組大鼠心電消失時(shí)間均顯著延長(P<0.05)。維拉帕米組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 心電ST段總偏移實(shí)驗(yàn)各組大鼠∑ST比較 見表4。

表4 心電ST段總偏移實(shí)驗(yàn)各組大鼠∑ST比較

由表4可見，與溶媒組比較，硝酸異山梨酯組、高劑量組及中劑量組大鼠∑ST均明顯降低(P<0.05)。硝酸異山梨酯組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn)各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較 見表5。

由表5可見，與假手術(shù)組比較，溶媒組和低劑量組大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細(xì)胞比容均升高(P<0.05)。與溶媒組比較，硝酸異山梨酯組、高劑量組、中劑量組大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細(xì)胞比容均降低(P<0.05)。硝酸異山梨酯組、高劑量組、中劑量組及低劑量組全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細(xì)胞比容組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn)各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較

3 討論

黃芪屬膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿、利尿、生肌等作用，常用于氣虛乏力、久瀉脫肛、自汗、瘡口久不愈合等。補(bǔ)氣生血經(jīng)典名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪、當(dāng)歸5∶1組成，主治血虛陽浮發(fā)熱證。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療心血管系統(tǒng)疾病效果突出，包括抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌缺血、促進(jìn)血管新生等[13]?；跀?shù)據(jù)挖掘?qū)t(yī)大師劉祖貽561首含黃芪處方用藥規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，黃芪不同用量及多種配伍靈活應(yīng)用可治療多種病癥[14]。

黃芪甲苷作為黃芪皂苷類成分之一，被視為黃芪質(zhì)量控制的生物標(biāo)志物[15-16]，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、強(qiáng)心降壓及增強(qiáng)免疫力等藥理作用[17]，在治療心腦血管疾病方面應(yīng)用廣泛且取得一定成果。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可降低心肌梗死大鼠的梗死面積，通過抗炎、抗心肌纖維化改善大鼠急性心肌梗死后的心室重構(gòu)[18-19]。黃芪甲苷可激活HIF-1α信號(hào)，減輕心肌缺血再灌注損傷[20]，亦可通過抗心肌細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等發(fā)揮保護(hù)心肌作用[21]。此外，黃芪甲苷在改善血管內(nèi)皮損傷、保護(hù)腦神經(jīng)及腦血管等方面亦發(fā)揮著重要作用[22]。

心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞缺氧及各種營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，出現(xiàn)代謝異常和代謝產(chǎn)物異常堆積，最終致心肌細(xì)胞死亡。心臟缺血導(dǎo)致大鼠心臟組織細(xì)胞的缺氧，是一個(gè)基本的和重要的病理生理環(huán)節(jié)。同時(shí)，心肌缺血的形成與血液流變異常有密切聯(lián)系，血液黏度升高使血流阻力增加，流速減慢，甚至造成血液停滯，最終影響冠狀動(dòng)脈供血，誘發(fā)或加重心肌缺血[22]。因此，提高心肌的耐缺氧能力及改善血流狀態(tài)為防治缺血性心臟病的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，在耐缺氧實(shí)驗(yàn)中，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組均可不同程度地延長正常小鼠和ISO誘導(dǎo)的心肌缺氧小鼠在密閉缺氧條件下的存活時(shí)間(P<0.05)，提示黃芪甲苷葡萄糖注射液可增強(qiáng)小鼠心臟在缺氧狀態(tài)下的耐受性。在氣管夾閉狀態(tài)下，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組大鼠心電消失時(shí)間顯著延長(P<0.05)，提示黃芪甲苷葡萄糖注射液能提高小鼠心肌細(xì)胞抗缺血缺氧的能力，可有效保護(hù)心肌細(xì)胞。

心電圖ST段變化是判斷心肌缺血與否的主要指標(biāo)[3]。本實(shí)驗(yàn)中，與溶媒組相比，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組心電圖∑ST顯著降低(P<0.05)，提示該藥物可改善缺血心肌細(xì)胞的功能，保護(hù)缺血心肌。血液流變學(xué)作為血脈痹阻的客觀指標(biāo)，其異常多與穩(wěn)定型心絞痛痰瘀有關(guān)，臨床上表現(xiàn)為高黏度、高凝聚狀態(tài)及血小板聚集率增高等[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與心肌缺血大鼠溶媒組相比較，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細(xì)胞比容均明顯降低(P<0.05)。證明黃芪甲苷葡萄糖注射液可改善心肌缺血大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量可改善模型動(dòng)物的心肌缺血，其抗心肌缺血作用可能與增強(qiáng)心肌細(xì)胞耐缺氧能力、改善心肌缺血模型血液流變性有關(guān)。