朱德建 朱志侖 吳溧興 陸 曙

(江蘇省南京市溧水區(qū)中醫(yī)院心血管科，江蘇 南京 211200)

不穩(wěn)定性心絞痛(unstable angina，UA)是急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的一種常見類型，主要發(fā)病機制為不穩(wěn)定斑塊破裂。而動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的破裂是由細胞外基質(ECM)合成與分解的動態(tài)平衡失調造成的。ECM由膠原、糖蛋白和蛋白聚糖等物質構成?；|金屬蛋白酶(MMPs)具有水解彈性蛋白和明膠的能力，能夠破壞ECM的網狀結構，促進斑塊裂解[1]。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶，是造成易損斑塊破裂的主要降解酶之一。不穩(wěn)定斑塊易于破裂的側部(也稱肩區(qū))聚集大量的巨噬細胞、泡沫細胞，MMP-9表達明顯增加[2]。ACS患者冠狀動脈循環(huán)血漿及外周血清中MMP-9水平升高，且明顯高于穩(wěn)定型心絞痛患者,并與冠狀動脈狹窄程度有相關性[3-5]。在新生血管的病變斑塊中，MMP-9的表達顯著增強，頸動脈粥樣硬化斑塊中MMP-9的水平與斑塊的易損性及頸動脈閉塞呈正相關[6]。易損斑塊中新形成血管的脆性高，ECM的穩(wěn)定性極差，且新生的毛細血管易撕裂，觸發(fā)斑塊破裂，導致ACS。以上眾多研究提示，MMP-9可作為反映動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的標志物。2018年我們采用枳實薤白桂枝湯治療寒凝、痰濁、血瘀、氣滯證素UA患者32例，并與西醫(yī)標準治療30例對照，觀察對血清MMP-9水平及其基因表達的影響，結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院心血管科UA住院患者62例，按照隨機數(shù)字表法分為2組。治療組32例，男19例，女13例；年齡41～76歲，平均(62.88±7.97)歲；病程1～29年，平均(8.74±1.62)年；Braunwald心絞痛分級[7]：ⅠA級3例，ⅠB級8例，ⅡA級5例，ⅡB級12例，ⅢA級1例，ⅢB級3例；危險分層[7]：低危9例，中危19例，高危4例；合并癥：原發(fā)性高血壓21例，2型糖尿病10例，高脂血癥7例，肥胖8例；吸煙7例。對照組30例，男16例，女14例；年齡38～79歲，平均(62.90±7.94)歲；病程3～32年，平均(9.02±1.76)年；Braunwald心絞痛分級：ⅠA級3例，ⅠB級5例，ⅡA級7例，ⅡB級11例，ⅢA級2例，ⅢB級2例；危險分層[7]：低危10例，中危16例，高危4例；合并癥：原發(fā)性高血壓23例，2型糖尿病8例，高脂血癥9例，肥胖6例；吸煙4例。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標準 西醫(yī)診斷參照《非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南(2016)》[7]。①癥狀：典型心絞痛，表現(xiàn)為發(fā)作性胸骨后或心前區(qū)悶痛，壓榨緊縮感，可放射至左肩背、左臂(可達無名指和小指)、頸部、下頜部等，可伴有出汗、心悸、惡心、嘔吐、呼吸困難、窒息感，甚至暈厥。②一般無異常體征，可見心率增快，血壓升高，汗出，焦慮或驚恐。③心電圖：追蹤靜息時心電圖、心絞痛發(fā)作時心電圖和心電圖連續(xù)動態(tài)監(jiān)測，ST-T波動態(tài)變化最具診斷價值。ST段壓低≥0.1 mV，或T波倒置≥0.1 mV。④心肌損傷標志物：心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌鈣蛋白T(cTnT)、肌酸激酶(CK)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)正常或輕度異常。⑤冠狀動脈造影：冠狀動脈狹窄≥50%。根據病史、典型的心絞痛癥狀及相關輔助檢查，結合年齡和存在的冠心病危險因素，即可建立診斷。

中醫(yī)診斷參考《中醫(yī)內科常見病診療指南：中醫(yī)病證部分》[8]擬定。①寒凝：心胸疼痛，感寒疼痛加劇，肢體寒冷，苔薄白，脈沉緊。②痰濁：心胸窒悶或如物壓，身重困倦，胸脘痞悶，口黏膩不爽，咯吐痰涎，苔白膩或白滑，脈滑。③血瘀：心痛不已，刺痛感，痛處固定，胸悶心悸，舌紫或黯，舌有瘀斑，或舌下絡脈青筋暴露，脈澀。④氣滯：胸痛時作，痛無定處，胸脅脹滿，情志不暢可誘發(fā)或加重，或脘腹脹悶，噯氣或矢氣則舒，時欲太息，脈弦。

1.2.2 納入標準 符合上述西醫(yī)診斷及中醫(yī)證素診斷標準中的任一證素；年齡30～80歲；受試者知情同意；本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2.3 排除標準 急性心肌梗死、肺栓塞、主動脈夾層、左室流出道梗阻性疾病(如主動脈瓣狹窄、梗阻性肥厚型心肌病)等；急性感染、凝血功能異常者；嚴重肝、腎疾病及腫瘤、精神病患者。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 予西醫(yī)標準治療。根據文獻[7]制定方案，進行抗栓治療、他汀類、抗心肌缺血治療。阿司匹林腸溶片(Bayer S.p.A，國藥準字J20130078)100 mg，每日1次口服；硫酸氫氯吡格雷片(樂普藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20123115)75 mg，每日1次口服；阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H19990258)20 mg，每晚1次口服；琥珀酸美托洛爾緩釋片(AstraZeneca AB，國藥準字J20150044)47.5 mg，每日1次口服；單硝酸異山梨酯分散片(魯南貝特制藥有限公司，國藥準字H20052095)20 mg，每日2次口服。

1.3.2 治療組 在對照組治療基礎上加枳實薤白桂枝湯。藥物組成：枳實12 g，厚樸12 g，薤白9 g，桂枝6 g，瓜蔞皮12 g，瓜蔞仁12 g。日1劑，水煎2次取汁300 mL，分早、晚2次溫服。

1.3.3 療程 2組均連續(xù)治療2周。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 中醫(yī)證候評分 參照文獻[8]擬定評分標準。主癥胸痛胸悶分為無、輕度、中度、重度4個等級，分別記0、2、4、6分；次癥心悸、氣短、畏寒、體寒肢冷、痰涎、口黏、善太息、脘腹脹悶分為無、輕度、中度、重度4個等級，分別記0、1、2、3分。舌苔、脈象：舌質淡，舌體胖大邊有齒痕，或苔白滑、白膩或濁膩，舌質紫黯，或有瘀斑，脈沉緊、脈滑、脈澀、脈弦，舌苔、脈象異常各記2分，正常記0分。

1.4.2 心絞痛情況 觀察并記錄2組治療前后心絞痛發(fā)作次數(shù)(每周)和持續(xù)時間、硝酸甘油用量(每周)。

1.4.3 血清MMP-9水平 收集2組患者治療前后空腹肘靜脈血2 mL，3000 r/min離心10 min，分離出血清，-80 ℃低溫保存，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定MMP-9水平，試劑盒為上海信然實業(yè)有限公司生產。

1.4.4 MMP-9基因表達水平 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)測定。①全血總RNA抽提。治療前后收集2組患者靜脈血2 mL，注入2%乙二胺四乙酸二鈉抗凝管，加入TRIzol試劑，按照試劑盒(上海博彩生物科技有限公司)說明書提取全血總RNA，-80 ℃冰箱保存總RNA提取物。采用BIO-RAD SmartSpecTMPlus核酸蛋白測量儀(美國BIO-RAD公司)測定RNA濃度，相對定量檢測采用實時熒光定量PCR技術進行。②cDNA合成。按照TAKARA逆轉錄反應試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]說明書將總RNA逆轉錄合成cDNA。③實時熒光定量PCR反應。將cDNA加入擴增反應體系，行實時熒光定量PCR檢測。采用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ試劑盒[DRR083S，寶生物(大連)工程有限公司]，LightCycler?480實時熒光定量PCR儀(美國羅氏)。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL，包括2×SYBR?Premix Ex TaqTM，1ng-100 ng cDNA，50 pmol/μL引物。兩步法PCR循環(huán)條件：95 ℃預變性30 s，1個循環(huán)；95 ℃變性30 s，60 ℃退火、延伸20 s，40個循環(huán)；溶解曲線分析 95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s， 95 ℃ 1 s。④實時熒光定量PCR校正品構建及相對定量分析。采用LightCycler Relative Quantification (Version 1.5)軟件進行相對定量分析，標準化比值計算公式采用2-△△CT法。設甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參基因。內參基因和目的基因校正品均使用20個健康樣本外周血總RNA?！鰿T (樣本)= CT目的基因- CT內參基因，△CT (校正品)= CT目的基因- CT內參基因，△△CT = △CT (樣本)- △CT (校正品)?！鳌鰿T(2-△△CT值)即為MMP-9基因表達的相對定量值。引物設計由南京金斯瑞公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 2組治療前后中醫(yī)證候評分比較 見表2。

表2 2組治療前后中醫(yī)證候評分比較 分，

由表2可見，治療后治療組胸痛胸悶、心悸、氣短、畏寒、體寒肢冷、脘腹脹悶、舌脈評分及總分均較本組治療前下降，且均低于對照組治療后，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療后對照組胸痛胸悶、心悸、氣短評分及總分均較本組治療前下降，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

2.2 2組治療前后心絞痛情況比較 見表3。

表3 2組治療前后心絞痛情況比較

由表3可見，治療后2組心絞痛發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時間及硝酸甘油用量均較本組治療前降低，且治療組均低于對照組，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 2組治療前后血清MMP-9及其基因表達水平比較 見表4。

表4 2組治療前后血清MMP-9及其基因表達水平比較

由表4可見，治療后2組血清MMP-9水平及其基因表達水平均較本組治療前降低，且治療組治療后血清MMP-9水平低于對照組治療后，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

UA是一種心血管慢性炎癥的急性惡化疾病，其主要病理過程有血管內膜損傷、脂質沉積、斑塊形成、斑塊破裂和血栓形成。動脈粥樣硬化是對血管內皮損傷的一種保護性炎性反應，表現(xiàn)為纖維增生，如果損傷持續(xù)，則回應過度，最終形成斑塊[9]。在動脈粥樣硬化斑塊的整個形成過程中，脂質沉積是早期損傷反應的表現(xiàn)。白細胞和單核細胞激活成活化的巨噬細胞，通過清道夫受體攝取氧化低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL-C)，成為泡沫細胞。泡沫細胞死亡后，釋放血漿脂蛋白和膽固醇酯，并沉降堆積，構成斑塊內脂質池。炎性反應繼續(xù)，引發(fā)纖維性增生，生成斑塊表面的纖維帽。纖維帽的主要成分是平滑肌細胞，由血管內皮中膜的平滑肌細胞增殖、遷移而成。此類平滑肌細胞無法維持正常的收縮性能，可以分泌膠原蛋白、蛋白多糖和一些整合素，這些物質是ECM的重要組成部分。早期的動脈粥樣硬化斑塊脂質池小，纖維帽厚，斑塊表現(xiàn)為穩(wěn)定狀態(tài)，但伴隨著血漿脂蛋白的沉積，脂質池逐漸變大，與此同時，單核-巨噬細胞或肥大細胞浸潤分泌蛋白酶(具有水解能力)，特別是金屬蛋白酶，通過降解膠原纖維和抑制纖維的合成，使得纖維帽變薄，斑塊破裂的風險增大，斑塊由穩(wěn)定向不穩(wěn)定狀態(tài)轉變，外在常見因素有血壓增高、血管痙攣、血管收縮和擴張產生的剪切力，在內、外因素的合力影響下，斑塊破裂，導致UA的發(fā)生。易損斑塊的破裂與纖維帽厚度、脂質核心大小、炎性反應強度有著緊密關系。目前，UA的臨床治療以藥物治療為主，如抗血小板聚集藥物(阿司匹林腸溶片、硫酸氫氯吡格雷片)、他汀類調節(jié)血脂藥(阿托伐他汀鈣片)、選擇性β1受體阻滯劑(美托洛爾)、硝酸酯類藥物(單硝酸異山梨酯)等以抑制血小板聚集，調節(jié)血脂，舒張冠狀動脈，改善UA患者心絞痛癥狀，但患者用藥后容易產生藥物不良反應。

MMPs是一組系列蛋白水解酶，其濃度升高與纖維帽降解、ACS的發(fā)生呈線性相關[10-11]。研究表明，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9表達在冠狀動脈斑塊中顯著增加[12]。MMP-9屬于MMPs家族的一員，其基因長7.7 kb，含13個外顯子和12個內含子，位于染色體的20q11.2～13.1，26～27kbp區(qū)，其底物包含天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原及變性Ⅰ型膠原、纖維蛋白原(FIB)和蛋白聚糖等[13]。MMP-9具有MMPs的共同結構特點，是一類蛋白水解酶，在體內以酶原的形式從細胞中釋放出來，通過蛋白酶的級聯(lián)反應被激活，其活性依賴于內源性Zn2+及Ca2+的存在。此外，MMP-9與彈性蛋白和明膠酶有較高的親和力，因而具有較強的水解彈性蛋白和明膠的能力。研究證實，ACS患者MMP-9水平增高，且與斑塊的易損性相關(用頸動脈血管超聲評價斑塊狀態(tài)，可分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊)，不穩(wěn)定斑塊中MMP-9的含量高于穩(wěn)定斑塊，對嚴重心絞痛、急性心肌梗死、再次血運重建、心源性死亡等心臟事件的發(fā)生有預測作用[14]。動物實驗研究也表明，MMP-9在造模成功的動脈粥樣硬化鼠的主動脈中高表達，提示MMP-9與動脈粥樣硬化相關，且其濃度與冠狀動脈病變支數(shù)和狹窄程度呈正相關性[15]。由此可推測，MMP-9可作為易損斑塊的實驗室標志物，對評估冠狀動脈病變程度有一定價值，在一定程度上可指導臨床診治[16]。相關研究還發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者的MMP-9濃度升高，且與升主動脈彈性降低相關[17]。

UA屬中醫(yī)學“胸痹心痛”范疇?！督饏T要略·胸痹心痛短氣病脈證治》載“陽微陰弦，即胸痹而痛”，指出胸痹心痛的病機是上焦陽氣虛，下焦陰寒盛，胸陽痹阻，又“今陽虛知在上焦，所以胸痹、心痛者，以其陰弦故也”，從正虛與邪盛2個方面揭示了胸痹心痛的病因病機，強調了上焦陽虛為發(fā)病之本，下焦陰寒、水飲、痰濁等邪氣上逆為發(fā)病之標，為本虛標實之證，標實以寒凝、痰濁 、血瘀、氣滯為主。寒為陰邪，其性凝滯，寒氣侵襲人體，胸中凝結，脈管攣縮，血脈阻滯，發(fā)生胸痹。寒氣侵心，抑遏胸陽，寒氣凝滯，則血不行為瘀，氣不行為滯；寒凝血瘀氣滯使胸陽失運，心脈阻滯，胸痹而痛。氣行不暢而為滯，心氣郁結，運行無力，氣血失暢，痹阻不通而發(fā)心痛。痰源于津不化，瘀源于血不行，痰濁黏膩，阻滯血液運行，血運不暢為血瘀，血瘀則氣機痹阻，氣不行則津不化，津液失于氣化，凝結為痰濁。痰可致瘀，瘀可致痰，痰瘀膠結，更為壅滯，壅塞胸中，猝然心痛欲窒。寒凝、痰濁、血瘀、氣滯等實邪痹阻胸陽，阻滯心脈，發(fā)為胸痹。

枳實薤白桂枝湯宣痹通陽，瀉滿降逆，適宜胸痹偏實證。瓜蔞皮清熱化痰，利氣開郁，寬胸散結；瓜蔞仁清潤化痰；薤白辛散苦降，行氣導滯，溫通滑利，善散陰寒凝滯，通胸陽閉結，《本草綱目》載其“下氣散血”，與瓜蔞皮、瓜蔞仁相配能化痰通陽，行氣止痛，共為君藥。枳實辛行苦降，善破氣除痞，行氣化痰以消痞，破氣除滿而止痛；厚樸苦燥辛散，能燥濕，又下氣寬中、除脹滿，還可燥濕消痰，下氣平喘，《名醫(yī)別錄》云“主溫中，消痰下氣”，兩者皆為臣藥，以理氣通脈。桂枝辛甘性溫，辛散溫通，溫通經脈，散寒止痛，既可溫扶脾陽以助運水，又可溫腎陽，助心陽，通利血脈，為佐藥，奏溫散寒邪、通陽止痛之功。諸藥配伍，振奮胸陽，消除陰寒，降散痰濁，暢利氣機，則諸癥可除。既往研究顯示，枳實薤白桂枝湯能降低UA患者血清MMP-9、升高基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的水平，調節(jié)ECM的動態(tài)平衡，提高粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，緩解心絞痛癥狀，促進心電圖缺血性ST-T段改變的恢復[18-19]。

本研究結果顯示，枳實薤白桂枝湯能夠降低UA患者血清MMP-9水平及MMP-9基因表達水平(P<0.05)，且血清MMP-9水平較常規(guī)治療更低(P<0.05)，從而更有效地防止冠狀動脈粥樣硬化斑塊纖維帽消化降解，穩(wěn)定易損斑塊，從而發(fā)揮治療作用，較常規(guī)治療更能改善患者中醫(yī)證候(P<0.05)，減少心絞痛發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時間及硝酸甘油用量(P<0.05)，值得臨床借鑒。