張 浩，權(quán)天龍

腦出血是常見的急性腦病之一。在過去10年內(nèi)，全球腦卒中9%～27%是由腦出血引起的。腦出血病人常預(yù)后不良，疾病初期病人生存率較低[1]。腦出血病變部位血液迅速壓迫腦實(shí)質(zhì)，導(dǎo)致血腫和腦部血液循環(huán)障礙、血腫周圍形成水腫、血腦屏障損傷在內(nèi)的繼發(fā)性腦損傷[2]。有研究表明，炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與腦出血后繼發(fā)性腦水腫及腦組織損害過程[3]。腦出血后炎癥反應(yīng)主要發(fā)生在白細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞釋放核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等多種毒性因子，進(jìn)一步加重腦損傷[4]。目前治療腦出血的內(nèi)科手段為使用藥物減輕腦水腫、降血壓、預(yù)防腦疝形成等，外科以清除腦血腫為主要方法[5]。目前治療急性期腦出血可快速起效，但恢復(fù)期仍需針對(duì)性加強(qiáng)抗炎治療幫助神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)和恢復(fù)。塞來昔布主要用于緩解骨關(guān)節(jié)炎癥狀和急性疼痛，也可用于癌癥的治療[6]。有研究表明，塞來昔布能有效減輕腦出血病人腦水腫[7]。關(guān)于塞米昔布在腦出血恢復(fù)期抗炎抗神經(jīng)毒性機(jī)制的研究較少。本研究以雄性SD大鼠為研究對(duì)象，將大鼠頭部置入導(dǎo)管注射股動(dòng)脈血建立腦出血模型，腹腔注射塞來昔布和Toll樣受體4(TLR4)抑制劑(TAK-242)進(jìn)行干預(yù)，通過觀察大鼠神經(jīng)功能損傷和檢測(cè)TLR4、NF-κB、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLT-1)水平，探討塞來昔布對(duì)腦出血模型大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路及GLT-1的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠90只，體重(230±20)g，鼠房模擬晝夜交替(12 h/12 h)，溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度37%～47%。動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，定期更換墊料。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 塞來昔布(美國(guó)輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：20180510，規(guī)格：每片200 mg)，TAK-242(美國(guó)MCE公司生產(chǎn)，貨號(hào)：HY-11109)，兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗NF-κB p105/p50單克隆抗體、兔抗GLT-1單克隆抗體和兔抗GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab217274、ab32360、ab205247、ab181602，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：BA1054)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與給藥 將90只雄性SPF級(jí)SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和抑制劑組，造模成功后向大鼠腹腔注射給藥，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別腹腔注射塞來昔布50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)[8]，抑制劑組以3 mg/(kg·d)注射TAK-242[9]，連續(xù)給藥2周后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 動(dòng)物造模 為保證動(dòng)物造模成功和一致性，采用大鼠右側(cè)尾狀核置入套管注射股動(dòng)脈血方法構(gòu)建腦出血模型[10]。SD大鼠以3%戊巴比妥鈉(1.2 mL/kg)腹腔注射麻醉，待針刺大鼠四肢無明顯搔爬反應(yīng)，將頭部固定在數(shù)顯腦立體定位儀上。打開大鼠頭皮找到前囟，以前囟為原點(diǎn)，定位右側(cè)尾狀核(A 2.0，L3.0)。顱骨鉆打開此點(diǎn)約1.5 mm2面積顱骨，向尾狀核置入套管，醫(yī)用腦膠封閉傷口。周圍顱骨打入自攻螺絲，牙科水泥固定套管。待牙科水泥凝固后，從定位儀上取下大鼠，待其蘇醒后靜養(yǎng)1周用于造模。

麻醉大鼠，使用頭皮針采集大鼠股動(dòng)脈血0.4 mL待用，擰開套管帽拔出套管內(nèi)芯，微量進(jìn)樣器連接套管內(nèi)管吸取50 μL大鼠自體股動(dòng)脈血，將套管內(nèi)管插入套管完成注射，停留2 min再拔出內(nèi)管，套管內(nèi)芯插入套管，擰上套管帽。假手術(shù)組以50 μL生理鹽水代替。造模完成后第1天給藥，無法自主進(jìn)食的大鼠進(jìn)行輔助灌胃。

1.3.3 樣本采集 對(duì)所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)評(píng)分測(cè)試。測(cè)試后進(jìn)行腹腔麻醉，使用解剖針將四肢固定在蠟盤上。每組選5只大鼠，用手術(shù)剪打開胸腔，眼科剪刀剪開心包膜暴露心臟后灌入生理鹽水，直至右心房流出清水樣液體，繼續(xù)灌入4%多聚甲醛，頸部和四肢僵硬1 min后停止灌流，取出右腦組織于4 ℃條件下4%多聚甲醛中固定24 h用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。其余10只大鼠直接取右腦組織，保存-80 ℃冰箱中待用，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚含酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western Blotting)檢測(cè)。

1.3.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定 各組大鼠結(jié)束給藥12 h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定，參照改良Bederson評(píng)分法[11]。5分法：評(píng)分<1分，無明顯神經(jīng)功能損傷；評(píng)分1～<2分，輕度損傷，提尾懸空時(shí)無法順利伸展左前肢；評(píng)分2～<3分，中度損傷，前行時(shí)向左打彎；評(píng)分3～<4分，中重度損傷，站立不穩(wěn)并左側(cè)；評(píng)分4～<5分，重度損傷，不能自發(fā)行走、意識(shí)不清。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦組織GLT-1表達(dá) 采用0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)將免疫組化提取的腦組織清洗干凈，使用手術(shù)刀片冠狀切面截取導(dǎo)管針前后約2 mm腦組織，脫水、透蠟、包埋，之后石蠟組織切片，切片厚度約6 μm。切片脫蠟至水，對(duì)切片進(jìn)行微波抗原修復(fù)。5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，加兔抗鼠GLT-1單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃條件下過夜，再加二抗37 ℃孵育1 h后，使用DAB試劑盒顯色，顯色過程控制顯色本底水平。沖洗掉DAB殘留后用水溶性封片劑封片，拍照獲得切片圖像。使用Image J 15.1軟件分析圖像陽性區(qū)域積分光密度。

1.3.6 RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織TLR4、NF-κB、GLT-1 mRNA表達(dá) 從-80 ℃冰箱中取每個(gè)部分組織，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA含量、純度后，再使用cDNA試劑盒合成cDNA。以GADPH為參比基因，分析各組mRNA含量，采用2-ΔΔCq法。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.7 Western Blotting檢測(cè)大鼠腦組織TLR4、NF-κB、GLT-1蛋白表達(dá)量 取1.3.6剩余組織在冰盒上研磨，加蛋白提取液后于冰塊上靜置1 h。4 ℃條件下高速離心15 min，使用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白含量和純度。待符合要求后進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后切下目的條帶，轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。5%小牛血清封閉，分別加入對(duì)應(yīng)的一抗二抗進(jìn)行孵育(一抗稀釋比例：TLR4 1∶200、NF-κB 1∶200、GLT-1 1∶500，二抗稀釋比例：1∶2 000)。顯色后使用凝膠成像儀曝光拍照，根據(jù)條帶分析各組蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，同時(shí)保留兩位小數(shù)，各組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能評(píng)分升高(P<0.05)；與模型組比較，抑制劑組和低劑量組、中劑量組、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分降低(P<0.05)；與抑制劑組、低劑量組比較，中劑量組、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(x±s) 單位：分

2.2 免疫組化檢測(cè)大鼠腦組織GLT-1表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組GLT-1積分光密度升高(P<0.05)；與模型組比較，抑制劑組和低劑量組、中劑量組、高劑量組GLT-1積分光密度降低(P<0.05)；與抑制劑組比較，低劑量組、中劑量組GLT-1積分光密度升高(P<0.05)，高劑量組GLT-1積分光密度降低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組GLT-1積分光密度降低(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組GLT-1積分光密度降低(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 各組大鼠腦組織GLT-1免疫組化圖像(×200)

表3 各組大鼠腦組織GLT-1積分光密度比較(x±s)

2.3 RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織TLR4、NF-κB、GLT-1 mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組TLR4、NF-κB、GLT-1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，抑制劑組和低劑量組、中劑量組、高劑量組TLR4、NF-κB、GLT-1 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)；與抑制劑組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組TLR4 mRNA表達(dá)均升高，低劑量組、中劑量組GLT-1 mRNA表達(dá)升高，低劑量組NF-κB mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組TLR4、NF-κB、GLT-1 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組TLR4、NF-κB、GLT-1 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB、GLT-1的mRNA表達(dá)比較

2.4 Western Blotting檢測(cè)大鼠腦組織TLR4、NF-κB、GLT-1蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組TLR4、NF-κB、GLT-1蛋白表達(dá)量均升高(P<0.05)；與模型組比較，抑制劑組和低劑量組、中劑量組、高劑量組TLR4、NF-κB、GLT-1蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05)；與抑制劑組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組TLR4均升高(P<0.05)，低劑量組、中劑量組NF-κB均升高(P<0.05)，低劑量組GLT-1蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組NF-κB蛋白表達(dá)量降低，高劑量組TLR4和GLT-1蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量均降低(P<0.05)。詳見圖2，表5。

圖2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB、GLT-1蛋白表達(dá)電泳圖

表5 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB、GLT-1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最多的興奮性氨基酸[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，清除谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體主要依靠星型膠質(zhì)細(xì)胞膜上GLT-1和谷氨酸-胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[13]，兩者通過攝取谷氨酸維持突觸間隙谷氨酸濃度處于低水平。GLT-1是含量豐富的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，前腦中超過90%的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)是通過GLT-1完成[14]。Zhou等[15]研究表明，通過下調(diào)NF-κB/GLT-1信號(hào)通路抑制GLT-1過表達(dá)，進(jìn)而減輕腦出血小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的谷氨酸神經(jīng)毒性。因此，抑制GLT-1過表達(dá)有利于減輕大鼠腦出血后谷氨酸神經(jīng)毒性。TLR4是一種跨膜識(shí)別蛋白，廣泛分布于血小板、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中。TLR4在免疫識(shí)別、炎癥調(diào)節(jié)等各個(gè)方面發(fā)揮重要作用[16]。TLR4受體復(fù)合物與NF-κB關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子結(jié)合，促使NF-κB抑制蛋白激酶磷酸化，引起NF-κB核轉(zhuǎn)位，使腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-β、白細(xì)胞介素-6等促炎因子過表達(dá)，從而加重炎癥反應(yīng)[17]。因此，抑制TLR4/NF-κB通路可減輕腦出血部位炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)功能評(píng)分、TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)、NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組。Teng等[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠腦出血模型建立后6～72 h 內(nèi)TLR4 mRNA和NF-κB蛋白表達(dá)不斷增加，并長(zhǎng)期維持較高水平。與模型組結(jié)果相符，說明動(dòng)物造模成功。TAK-242可抑制TLR4表達(dá)，而抑制劑組TLR4水平低于假手術(shù)組。與模型組比較，抑制劑組NF-κB水平降低，這可能是TLR4在TLR4/NF-κB通路中的下調(diào)作用引起。

塞來昔布屬于非甾體消炎藥，是一種常見的選擇性環(huán)氧酶2抑制劑。有研究表明，塞來昔布可能通過抑制NF-κB進(jìn)而抑制環(huán)氧酶2表達(dá)[19]。各劑量組NF-κB較模型組顯著下降，且隨劑量增大呈下降趨勢(shì)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布干預(yù)癲癇模型大鼠后，血清、腦皮質(zhì)和海馬中TLR4 mRNA均降低，說明塞來昔布可能對(duì)TLR4有下調(diào)作用。低劑量組、中劑量組、高劑量組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)量與劑量呈負(fù)相關(guān)[20]。Gupta等[21]研究表明，腦外傷時(shí)NF-κB對(duì)GLT-1基因表達(dá)有上調(diào)作用。與模型組比較，抑制劑組、低劑量組、中劑量組、高劑量組GLT-1均降低。NF-κB是除了TLR3外其他TLRs的共同下游分子[22]。抑制劑組TLR4水平最低，抑制劑組NF-κB和GLT-1蛋白和mRNA表達(dá)量與高劑量組比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明通過TLR4/NF-κB通路抑制TLR4間接下調(diào)GLT-1作用有限。這可能是由于抑制TLR4過程中，其他TLRs活化補(bǔ)償NF-κB下調(diào)。塞來昔布可下調(diào)NF-κB水平，一方面下游腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-β等促炎因子降低有利于減輕神經(jīng)元損傷、凋亡，另一方面抑制GLT-1過表達(dá)有利于控制腦出血后谷氨酸神經(jīng)損害。從神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果來看，塞來昔布能顯著改善腦出血后大鼠神經(jīng)功能。

綜上所述，塞來昔布通過下調(diào)腦出血大鼠TLR4/NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用保護(hù)腦組織，同時(shí)調(diào)控GLT-1過表達(dá)進(jìn)而減輕谷氨酸神經(jīng)毒性。