劉標,喻孟元,王震,杜東霞,陳薇,許麗娟,吳迎奔,吳民熙,劉惠知,尹紅梅
(湖南省微生物研究院,長沙 410009)
鄰苯二甲酸酯(又稱酞酸酯,Phthalic acid ester,PAEs),是塑料制品中常用的增塑劑,被普遍應用于玩具、化妝品、食品包裝材料、醫(yī)療用具、建筑裝飾等行業(yè)的數(shù)百種產品中[1],據(jù)統(tǒng)計,全世界每年的使用量達600 萬~800 萬t[2]。鄰苯二甲酸酯在各種塑料制品中主要依靠氫鍵、范德華力結合在母體上,連接不牢固,易在塑料制品的生產、使用過程中釋放到環(huán)境中[3-4]。目前在土壤、水體、水體沉積底泥,甚至動植物中都檢測出鄰苯二甲酸酯[5-9]。鄰苯二甲酸酯是一類內分泌干擾物,在動物體中表現(xiàn)出類似性激素的作用,主要危害動物的呼吸、生殖系統(tǒng)。隨著農業(yè)規(guī)?;陌l(fā)展,農田土壤中鄰苯二甲酸酯含量越來越高,對人類健康存在潛在的風險。目前鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)等6 種鄰苯二甲酸酯被美國環(huán)境保護署、歐盟、中國國家環(huán)境監(jiān)測中心列為優(yōu)先控制有機污染物[10]。PAEs 在環(huán)境中的自然降解速率較慢,而添加PAEs 降解微生物可大幅提高其降解速率[11-12],同時,由于微生物降解技術具有價格低廉、易操作等優(yōu)點,被認為是較有前景的修復技術之一,成為目前的研究熱點。目前,已分離篩選到大量能夠降解鄰苯二甲酸酯的微生物菌株,如假單胞菌、戈登氏菌、節(jié)桿菌、鐮刀菌、紅球菌等[7,13-17],但大部分微生物菌株主要是以單一的鄰苯二甲酸酯為降解對象而篩選獲得的,而實際環(huán)境中往往存在多種復合污染物,因此,篩選出能夠適應復合污染環(huán)境且具有PAEs降解功能的微生物菌株具有重要的研究意義和實用價值。
本研究以長側鏈的DOP 為降解對象,篩選具有一定重金屬鎘耐受性的微生物降解菌株,并對菌株的降解特性進行研究,期望為重金屬鎘和DOP復合污染的農田土壤修復提供微生物資源和理論依據(jù)。
DMP、DBP、DEP、DOP、DEHP、PA(鄰苯二甲酸)均購自國藥試劑有限公司,純度>99%;試驗中其他化學試劑為分析純,有機溶劑均為色譜級。
微生物分離樣品為湖南省長沙市望城區(qū)和瀏陽市采取的農田土壤。
含鎘無機鹽培養(yǎng)基(Mineral salt medium,MSM):K2HPO45.8 g·L-1,KH2PO44.5 g·L-1,(NH4)2SO42.0 g·L-1,NaCl 0.75 g·L-1,MgCl20.16 g·L-1,CaCl20.02 g·L-1,CdCl20.05 g·L-1,F(xiàn)eCl30.002 g·L-1,pH 7.0。
各底物培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入甲醇溶解的DMP、DBP、DEP、DOP、DEHP、PA母液,水浴加熱使甲醇揮發(fā),待甲醇完全揮發(fā)后再加入MSM 配制成所需濃度的各種底物培養(yǎng)基。
稱取土壤樣品5 g 置于裝有100 mL 含鎘MSM 培養(yǎng)基的三角瓶中,MSM 培養(yǎng)基中添加終濃度為100 mg·L-1DOP 的甲醇溶液,待甲醇溶液揮發(fā)后,在30 ℃、180 r·min-1搖床中遮光振蕩培養(yǎng)7 d,然后取1 mL 培養(yǎng)液轉移到下一DOP 濃度的MSM 培養(yǎng)基中,在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。以此相同步驟進行馴化培養(yǎng),DOP 濃度分別為200、300、400、500、600 mg·L-1,共馴化6個周期,獲取既耐鎘又對DOP具有降解能力的菌液。通過稀釋涂布平板法在固體MSM 培養(yǎng)基平板上篩選單菌落,并通過四分區(qū)劃線法進一步純化單菌落。將分離獲得的各菌株在MSM 試管斜面上培養(yǎng)7 d,4 ℃低溫保存待用。
將初篩獲取的5 株菌株接種在MSM 培養(yǎng)基(DOP 500 mg·L-1)中,30 ℃、180 r·min-1活化培養(yǎng)24 h,離心收集菌體,MSM 液體培養(yǎng)基重懸各菌體,使菌液濃度OD600約為0.2,即為各菌株的種子液。分別接種1 mL 各菌株的種子液到初始DOP 濃度為500 mg·L-1的MSM 培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r·min-1遮光培養(yǎng),分別在第96、120 h 測定各培養(yǎng)液中剩余的DOP 含量,以不接種的空白培養(yǎng)基為對照,計算各菌株對DOP的降解率。
利用高效液相色譜法測定菌液中的DOP 含量,采用外標法定量,在選定的色譜條件下進樣,以峰面積對DOP 濃度構建標準曲線。樣品前處理方法:在培養(yǎng)液中加入50 mL 二氯甲烷萃取,收集有機相,重復萃取兩次。將兩次萃取液合在一起,在旋轉蒸發(fā)儀上將二氯甲烷蒸發(fā)接近干燥,然后加入10 mL 甲醇溶解萃取物,經0.22 μm 有機相過濾器過濾后,用高效液相色譜儀(HPLC,Agilent公司)測定DOP含量。
HPLC 條件:色譜柱為Agilent Eclipse XDB-18(200 mm×4.6 mm,5 μm),流動相甲醇∶水=95∶5,進樣量20 μL,柱溫35 ℃,流速1 mL·min-1,檢測波長228 nm。
利用平板劃線法在含DOP的MSM 平板上接種菌株PD-2,培養(yǎng)4 d后觀察其菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征。
菌株16S rDNA 序列分析:用Ezup 柱式細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株PD-2的基因組DNA,采用通用引物27F 和1492R 進行16S rDNA 序列的擴增。PCR 反應條件:95 ℃預變性4 min;95 ℃,45 s;56 ℃,45 s;72 ℃,90 s,30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃終止。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,利用膠回收試劑盒純化回收,委托上海生物工程有限公司測序。測得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對,通過Mega 5.0軟件中Neighbor-joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,確定該菌的分類地位。
1.6.1 菌株PD-2的生長曲線及降解動力學曲線
將PD-2 的種子液,按1%接種量(V/V)加至MSM液體培養(yǎng)基中,DOP 初始濃度為500 mg·L-1,30 ℃、180 r·min-1遮光振蕩培養(yǎng),分別在12、24、36、48、72、96、120、144 h 取樣測定菌液的OD600和剩余的DOP 含量,每個處理重復3次。
1.6.2 不同初始DOP濃度對菌株PD-2降解能力的影響
在MSM 培養(yǎng)基中加入DOP 溶液,使其初始濃度分別為100、200、300、400、500、600、800、1 000、1 200 mg·L-1,按1%接種量接種PD-2 種子液,30℃、180 r·min-1遮光振蕩培養(yǎng)4 d 后測定菌液中剩余的DOP 含量,以不接菌作為空白對照,計算第4 d的降解率。
1.6.3 菌株PD-2鎘耐受能力測定
配制含鎘濃度分別為100、200、400、600、800、1 000、1 500、2 000 mg·L-1MSM(DOP 初始濃度為500 mg·L-1)培養(yǎng)基,按1%接種量接種PD-2 種子液,30 ℃、180 r·min-1遮光振蕩培養(yǎng)4 d 后測定菌液的OD600,每個處理重復3次,探究菌株對鎘的耐受能力。
1.6.4 菌株PD-2對不同碳源底物的利用
在MSM 培養(yǎng)基中分別添加DMP、DBP、DEP、DEHP、PA、DOP 作為碳源底物,初始濃度均為500 mg·L-1,接種PD-2 后按相同條件培養(yǎng)4 d,測定各菌液的OD600,每個處理重復3 次,探究菌株對不同碳源的利用能力。
試驗所用土壤為農田水稻土(未檢出DOP),參考《土壤農化分析》[18]中的方法測定理化性質:有機質19.8 g·kg-1,全氮0.68 g·kg-1,全磷0.84 g·kg-1,全鉀5.78 g·kg-1,鎘0.41 mg·kg-1,pH 6.53,土樣經自然風干過20目篩后備用。將200 g 土壤置于500 mL 錐形瓶中,添加DOP 溶液,調節(jié)終濃度約為100 mg·kg-1,配制成人工污染土壤。接種PD-2 的種子液到土壤中,終濃度約為1.0×108CFU·g-1,以不接種的土壤為空白對照組,將錐形瓶放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng),分別在0、5、10、15、20、25、30 d時取樣測定剩余DOP含量。
土壤樣品中DOP 含量的檢測[19]:取土壤樣品1.0 g 放入玻璃離心管中,加入30 mL 丙酮/己烷(V/V,1∶1)混合溶液,超聲提取10 min,靜置后收集有機相,重復以上步驟3 次,合并有機相,旋轉蒸發(fā)近干后,加入5 mL 甲醇溶解(加標回收率約為93%)。將提取液過0.22 μm 有機相濾膜,過濾后轉移至色譜瓶中,檢測方法同1.4節(jié)。
采用Excel 2003軟件對3次平行實驗的數(shù)據(jù)求平均值和標準差,并進行繪圖,利用SPSS 18.0軟件進行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計分析。
隨著化肥、農藥和農用塑料地膜等生產物資的大量使用,我國農田土壤表現(xiàn)出越來越明顯的復合污染,鎘和鄰苯二甲酸酯就是其中一種典型代表[20]。本研究通過選擇培養(yǎng)基的富集、馴化,分離獲得5 株既能耐受一定濃度的重金屬鎘,又能以DOP 為唯一碳源生長的細菌菌株。在初始DOP 濃度為500 mg·L-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h 后,5 株菌株均對DOP 有較明顯的降解作用。其中,菌株PD-2的降解率達到93.1%,顯著高于其他菌株(表1),且該菌株在血平板上不產生溶血現(xiàn)象,因此,選擇PD-2進行進一步研究。
表1 不同菌株對DOP的降解能力Table 1 The ability of different strains on the DOP degradation
菌株PD-2在含DOP的MSM固體培養(yǎng)基上形成的菌落較小,表面光滑、濕潤,有光澤、不透明,邊緣整齊。在油鏡下,PD-2的菌體呈不規(guī)則的卵球形,單個或多個排列在一起,不形成芽孢,革蘭氏染色陰性(圖1)。
圖1 菌株PD-2菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征Figure 1 Colony morphology and micromorphological characteristics of strain PD-2
PCR 擴增獲得PD-2 的16S rDNA 序列長度為1 380 bp(Genbank 登錄號:MT071604),將其與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有序列進行同源性比對,菌株與Hyphomicrobium facile(NR_027610.1)有很高的相似性(99%),基于其16S rDNA 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2 所示。結合菌株形態(tài)學特征和16S rDNA 序列分析的結果,初步將菌株PD-2 鑒定為生絲微菌。據(jù)報道,生絲微菌(Hyphomicrobiumsp.)主要用于合成吡咯喹啉醌[21]、降解甲胺磷、乙酰甲胺磷、水氨硫磷等農藥[22],本研究為首次將生絲微菌應用于DOP 污染土壤修復。
圖2 菌株PD-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of strain PD-2
如圖3 所示,菌株PD-2 在0~36 h 生長較慢,培養(yǎng)基中的DOP 含量下降也較為緩慢,說明該菌株在含DOP 的環(huán)境中適應期較長。36~72 h 是菌株PD-2 的對數(shù)生長期,DOP的含量在此期間迅速降低。72 h后菌株進入穩(wěn)定生長期,此時DOP 含量略有下降,第96 h 時DOP 下降至45.3 mg·L-1,降解率達到最大,為90.9%。96 h 以后進入衰退期,DOP 的含量不再有明顯變化。結合菌株的生長及降解曲線可知,菌株對DOP的降解依賴于其生物量的增加,可能是因為菌株在DOP 的誘導下通過分泌酯酶、鄰苯二甲酸降解相關酶[10]實現(xiàn)對DOP的降解,而酶的分泌與菌株的生長代謝密切相關。
PD-2 對不同初始濃度DOP 的降解效果(圖4)顯示,當DOP 初始濃度低于800 mg·L-1時,4 d 內PD-2對DOP 的降解率均超過90%,說明菌株對DOP 具有較強的耐受性。當DOP 濃度繼續(xù)提高時,降解率有較明顯的下降,這一結果與韓蕊等[23]、楊婧等[24]報道的菌株降解PAEs 的特性類似,原因可能是高濃度的DOP會對PD-2的生長繁殖或相關酶的分泌產生不利影響,從而影響菌株對其分解利用。
圖3 菌株PD-2利用DOP的生長降解曲線Figure 3 The growth curve and DOP degradation curve of strain PD-2
圖4 不同初始DOP濃度對PD-2降解能力的影響Figure 4 Effect of different initial DOP concentration on the biodegradation of PD-2
如圖5 所示,在鎘濃度為0~600 mg·L-1時,菌株PD-2的生長均較好,且無顯著差異,菌株具有相對較強的鎘耐受性。隨著培養(yǎng)基中鎘濃度的增加,PD-2仍能生長,但生物量顯著減少,說明高濃度的鎘對菌株生長有一定抑制作用,在鎘重度污染區(qū)菌株PD-2對DOP的修復效率會顯著降低。
培養(yǎng)4 d 后,菌株PD-2 在6 種底物液體培養(yǎng)基中均能生長,但生長狀況不同。其在含短側鏈酞酸酯底物(DMP、DEP、DBP)的培養(yǎng)基中生長較好,在長側鏈酞酸酯底物(DEHP、DOP)的培養(yǎng)基中生長相對較慢(表2)。這一結果與先前報道的菌株寡養(yǎng)假單胞菌B3[25]、分枝桿菌ASW6D[24]、Gordoniasp.JDC-2[26]特性類似。在實際污染環(huán)境中往往是多種鄰苯二甲酸酯類化合物并存,菌株PD-2不僅可降解DOP,還可利用其他種類的PAEs(表2),因此,該菌株在實際污染環(huán)境修復工程中具有潛在的應用價值。
圖5 鎘濃度對菌株PD-2生長的影響Figure 5 Effect of Cd2+concentration on the growth of strain PD-2
菌株PD-2在DOP污染土壤中降解效果如圖6所示,接種菌劑PD-2 到土壤30 d 后,DOP 的去除率達64%,而未接種的對照組為14.8%,說明菌劑PD-2 可顯著提高土壤中DOP 的去除率。添加菌劑PD-2 的處理組DOP 的降解在前5 d 較緩慢,第5~10 d 降解速度顯著增加,10 d后降解速率又變得較為緩慢。原因可能是在接種菌劑前期,菌株PD-2 與土壤中土著微生物存在競爭關系,其生長代謝受到一定抑制;第5~10 d降解速率加快是因為PD-2在與土著微生物的競爭中逐漸占據(jù)優(yōu)勢;后期降解速率變慢可能是因為DOP在土壤中進入緩慢吸附階段,其通過分配作用進入土壤微孔內或吸附在高能位點上,與土壤成分結合更加緊密,微生物對其降解也越困難[27]。
表2 菌株PD-2底物利用試驗Table 2 The test of strain PD-2 using the substrates
圖6 PD-2對污染土壤中DOP的降解效果Figure 6 Biodegradation of DOP by PD-2 in soil
(1)從農田土壤中篩選出一株既耐受重金屬鎘又可高效降解利用DOP 的菌株PD-2,在DOP 初始濃度為500 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h 后,其對DOP 的降解率可達93.1%。綜合菌株形態(tài)特征和16S rDNA 序列,將該菌鑒定為生絲微菌屬(Hyphomicrobiumsp.),本研究首次將獲得的生絲微菌用于降解土壤中DOP。
(2)菌株PD-2 對液體培養(yǎng)基中DOP 的降解依賴于其生物量的增加,其對DOP 的作用濃度和耐鎘濃度范圍廣,可高效降解100~800 mg·L-1范圍的DOP(降解率大于80%),在含鎘濃度0~600 mg·L-1的培養(yǎng)基中生長良好。PD-2 可利用其他常見PAEs 和鄰苯二甲酸作為底物生長,底物種類范圍廣。
(3)添加PD-2 到鎘和DOP 復合污染土壤中,其對DOP 的降解作用顯著,PD-2 在鎘和DOP 復合污染土壤的修復方面具有潛在的應用價值。