沈宗專，黃 炎，操一凡，王東升, 2，劉紅軍，李 榮*，沈其榮

健康與罹患青枯病的番茄土壤細(xì)菌群落特征比較①

沈宗專1，黃 炎1，操一凡1，王東升1, 2，劉紅軍1，李 榮1*，沈其榮1

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，國家有機(jī)類肥料工程技術(shù)研究中心，作物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 南京市蔬菜科學(xué)研究所，南京 210042)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及MiSeq高通量測序技術(shù)，全面地研究了連作番茄田塊中健康與感染青枯病植株周圍土體及根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成。結(jié)果表明：健康番茄土體土壤的pH及全碳含量顯著高于感病番茄土體土壤；土體及根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成明顯不同于感病番茄土體及根際土壤細(xì)菌群落。與感病番茄根際相比，健康番茄根際細(xì)菌的數(shù)量顯著升高而青枯菌數(shù)量顯著降低；細(xì)菌群落的Shannon多樣性指數(shù)顯著增高；擬桿菌門及其所含的噬幾丁質(zhì)菌屬、金桿菌屬、動桿菌屬、黃桿菌屬及的相對豐度顯著增高而變形菌門及其所含的青枯菌屬的相對豐度顯著降低。綜上，抑制土傳青枯病發(fā)生的番茄根際土壤細(xì)菌群落特征明顯，其生物量及多樣性高，土著有益菌群數(shù)量多而病原菌數(shù)量少，為番茄土傳青枯病的生物防控提供了指導(dǎo)方向與理論依據(jù)。

番茄青枯??；抑病型土壤；高通量測序；細(xì)菌群落多樣性；細(xì)菌群落組成

土壤生態(tài)系統(tǒng)是連接大氣圈、水圈、巖石圈和生物圈的紐帶，與地上生態(tài)系統(tǒng)之間緊密聯(lián)系、相互依存，共同決定著陸地生態(tài)系統(tǒng)的特征、過程和功能[1]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分，不僅在元素的生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用，也在作物健康生長和可持續(xù)生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用[2]。盡管植物與微生物的互作關(guān)系是土傳病害發(fā)生的重要決定因子[3]，但目前對于根際微生物區(qū)系組成與生態(tài)系統(tǒng)功能之間的關(guān)聯(lián)仍有待深入研究。

近年來農(nóng)用化學(xué)品的大量投入是作物持續(xù)高產(chǎn)的重要支撐之一，但同時(shí)也給土壤及環(huán)境的健康帶來了挑戰(zhàn)[4]。高強(qiáng)度集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)一定程度上破壞了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)平衡，削弱了土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能。尤以抑制土傳病害發(fā)生的能力(抑病能力)下降為甚，導(dǎo)致作物根腐病、枯萎病、全蝕病、立枯病等土傳病害頻繁爆發(fā)[5]。番茄是全世界栽培最為普遍的果菜之一，設(shè)施番茄產(chǎn)業(yè)已成為農(nóng)民增收的重要產(chǎn)業(yè)之一。然而，因青枯菌()侵染導(dǎo)致的番茄青枯病嚴(yán)重威脅著世界番茄種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6]。因此，土傳青枯病的有效防控仍是關(guān)系到世界番茄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大理論及技術(shù)問題。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成對于番茄抵御青枯菌的侵染有著重要影響[7]，因此，研究同一連作田塊中健康與罹患青枯病的番茄土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成差異對于番茄土傳青枯病的防控極其重要。然而，盡管已有大量研究表明調(diào)控土壤微生物區(qū)系可有效防控番茄青枯病的發(fā)生[6, 8-9]，但對于同一連作條件下健康與患病番茄土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與組成差異的研究仍相對缺乏。楊尚東等[10]利用傳統(tǒng)的分子生態(tài)學(xué)手段(PCR-DGGE)初步比較了番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征，但該研究手段不能揭示群落的組成差異；Li等[5]利用454焦磷酸測序技術(shù)研究比較了健康與患病番茄根際土壤及根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成特征，但未揭示與根際細(xì)菌裝配密切相關(guān)的土體土壤細(xì)菌群落差異。

因此，為全面揭示連作條件下健康與患病番茄的土體及根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成差異及探究土體細(xì)菌群落的差異與根際細(xì)菌群落組成差異之間的關(guān)系，本研究擬采集設(shè)施大棚內(nèi)長期連作番茄田塊中感染土傳青枯病植株的土體及根際土壤和健康植株的土體及根際土壤，利用熒光定量PCR 和 MiSeq 高通量測序技術(shù)比較設(shè)施大棚內(nèi)健康番茄與感染土傳青枯病番茄的土體及根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成差異，為番茄青枯病土壤的微生物區(qū)系調(diào)控提供理論依據(jù)和方向支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試種子 供試番茄種子為世紀(jì)紅冠(Mill., CV. Shijihongguan)，由南京市蔬菜花卉科學(xué)研究所提供。

1.1.2 試驗(yàn)點(diǎn)基本信息 試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)在江蘇省南京市蔬菜花卉科學(xué)研究所(31°43′N，118°46′E)。試驗(yàn)區(qū)域?yàn)榈湫蛠啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，年平均溫度為15.4 °C，年均降雨量達(dá)1 106 mm。試驗(yàn)設(shè)施土壤的基本性狀如下：供試土壤為黃崗?fù)粒琾H 6.33、有機(jī)質(zhì)23.56 g/kg、全氮1.89 g/kg、有效磷138 mg/kg、速效鉀464 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 番茄育苗 將供試番茄種子用2% 次氯酸鈉表面消毒3 min，再用無菌蒸餾水洗滌3次后在合適的溫度和水分環(huán)境下發(fā)芽。種子發(fā)芽后，播入育苗基質(zhì)中于育苗車間進(jìn)行培育。當(dāng)幼苗長出3 ~ 4片真葉時(shí)，選取長勢一致的幼苗進(jìn)行田間移植。

1.2.2 田間試驗(yàn) 供試設(shè)施大棚自2013年2月開始于每年春夏及秋冬兩季連續(xù)種植番茄。本試驗(yàn)于2015年2—6月在此設(shè)施大棚開展，此前已連續(xù)種植4季番茄，部分蕃茄植株已呈現(xiàn)出感染青枯病的癥狀。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為10 m2(長×寬=2 m×5 m)。種植前施用7 kg商品雞糞有機(jī)肥(N + P2O5+ K2O> 5%)及0.5 kg復(fù)合肥(N-P2O5-K2O，15- 15-15)作為基肥，視長勢追施尿素及氯化鉀。所用商品雞糞有機(jī)肥、復(fù)合肥、尿素及氯化鉀均為市售常見肥料?；适┤? d后，每個(gè)小區(qū)移栽32棵番茄種苗，種植密度為0.6 m × 0.6 m(株距×行距)。移栽定植番茄種苗20 d后，每周監(jiān)測番茄青枯病發(fā)生狀況。為盡量避免土壤過于濕潤所導(dǎo)致的潛在的細(xì)菌過度交叉污染，除定植移苗后一次性澆透以外，日常水分管理采取“少量多次”的策略，利用滴灌設(shè)施向番茄莖基部補(bǔ)充水分。

1.2.3 番茄土壤樣品采集及DNA提取 于番茄收獲期每小區(qū)分別隨機(jī)選定5株青枯病感病或健康(未明顯感病)植株，用鐵鏟將距番茄莖部10 cm以內(nèi)且0 ~ 20 cm深的土壤和根系一起挖取，將5株樣品混勻后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。輕抖根系，將附著根上的土壤抖落，連同土體土壤利用四分法保留約200 g土壤作為感病(DB)及健康(HB)土體土壤樣品。將去除輕松附著根系上的番茄根置入預(yù)先裝有150 ml無菌水的500 ml三角燒瓶中，室溫下以170 r/min震蕩30 min，震蕩后4 000 ×離心5 min，離心后沉淀即為根際土壤，將收集到的根際土壤混勻保存于–70 °C備用。稱取0.4 g土壤樣品，用土壤DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA)按操作說明提取土壤DNA并用核酸定量儀(NanoDrop 2000, USA)測定提取的土壤DNA核酸濃度。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)的測定 土壤理化性質(zhì)測定參照《土壤農(nóng)化分析》[10]。利用玻璃電極酸度計(jì)測定土壤pH((水)︰(土)=2.5︰1)；利用電導(dǎo)率儀測定土壤電導(dǎo)率(EC)((水)︰(土) =5︰1)；利用元素分析儀(Vario EL, Germany)通過干燒法測定土壤的全碳(TOC)和全氮(TON)含量；0.01 mol/L氯化鈣溶液浸提，流動分析儀(Auto Analyzer 3, Germany)測定土壤懸液的NH4+-N和NO– 3-N含量；醋酸銨浸提，火焰分光光度計(jì)測定土壤有效鉀(AK)含量；碳酸氫鈉浸提，鉬銻抗比色法測定土壤有效磷(AP)含量。

1.3.2 土壤細(xì)菌和青枯菌數(shù)量的測定 土壤細(xì)菌和青枯菌的數(shù)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定[12-13]。細(xì)菌擴(kuò)增采用引物Eub338/Eub518 (5′- ACTCCTA-CGGGAGGCAGCAG- 3′/5′- ATTACCGCG GCTGC-TGG - 3′)，青枯菌擴(kuò)增采用F/R (5′- GAACG-CCAACGGTGCGAACT - 3′/5′- GGCGGCCTTCA-GGGAGGTC-3′)。將含大腸桿菌16 S全長及青枯菌基因的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，采用ABI 7500熒光定量PCR儀，按照標(biāo)準(zhǔn)程序制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增條件為：10 μl SYBR?Premix Ex Taq，0.4 μl上游引物和下游引物，0.4 μl ROX Reference Dye，2 μl 模板DNA和 6.8 μl無菌水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 °C預(yù)變性30 s；95 °C預(yù)變性5 s，60 °C延伸34 s，循環(huán)40次。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)，用無菌超純水代替DNA模板設(shè)置為陰性對照。根據(jù)各樣品值計(jì)算每克土壤所含的拷貝數(shù)，并換算成每克干土形成的拷貝數(shù)，取對數(shù)值，以log (copies/g 干土) 表示。

1.3.3 細(xì)菌測序文庫構(gòu)建 參照Caporaso等[14]發(fā)表的方法構(gòu)建細(xì)菌測序文庫。細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增采用引物520F (5′- AYTGGGYDTAAAGNG - 3′)/802R (5′- TACNVGGGTATCTAATCC- 3′)。細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增體系為(25 μl)：5.0 μl 5 × Reaction Buffer、5.0 μl 5 × GC high Enhancer、2.0 μl dNTP (2.5 mmol/L)、1.0 μl上下游引物(10 μmol/L)、0.25 μl TaKaRa Polymerase (5 U/μl)、2 μl模板DNA及9.0 μl 無菌水。PCR擴(kuò)增條件為：98 °C預(yù)變性5 min；98 °C變性30 s，50 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最終72 °C延伸5 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收后利用BioTek酶標(biāo)儀對純化產(chǎn)物進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增子等摩爾濃度合并，然后用NEB Next? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs, UK)建庫，使用Agilent 2100 Bioanalyzer Instruments、Pico green和熒光分光光度計(jì)對文庫進(jìn)行質(zhì)量和濃度的檢測。多樣品測序文庫均一化至10 nmol/L后等體積混合，逐步稀釋定量至4 ~ 5 pmol/L后進(jìn)行上機(jī)測序。所有PCR擴(kuò)增、文庫準(zhǔn)備及上機(jī)測序均在上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.3.4 高通量數(shù)據(jù)分析 利用QIIME軟件對下機(jī)后的原始序列根據(jù)相應(yīng)的barcode信息進(jìn)行各樣品序列分配并去除接頭和引物序列；去除低質(zhì)量序列后，利用Usearch軟件對正反向序列進(jìn)行拼接；拼接后的序列參照UPARSE的標(biāo)準(zhǔn)流程分析，生成操作分類單元(OTU)表格并挑選出各OTU代表性序列[15]；利用RDP classifier將代表性序列與RDP 16S rRNA數(shù)據(jù)庫比對獲取各OTU分類組成信息[16]；最后，對去除所有樣品中相對豐度均小于0.01% 的OTU的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)多樣性分析。在Mothur軟件[17]內(nèi)基于Bray-Curtis參數(shù)計(jì)算各樣品主成分分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)比較各處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異；各樣品取平后，基于97% 相似度水平利用Mothur計(jì)算細(xì)菌群落豐富度Chao值及多樣性Shannon值；利用韋恩圖探究樣品之間組成上的差異性；各物種的相對豐度用該物種序列數(shù)除以該樣品總序列數(shù)的百分比表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

生物數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在IBM SPSS 20.0(SPSS Inc., Chicago, USA)及R語言中完成。采用多因素方差分析、多重比較及獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析比較處理間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康與感病番茄土壤基本理化性狀

即使在同一設(shè)施大棚小區(qū)內(nèi)，健康與感病番茄植株土體土壤的部分基本理化性質(zhì)差異明顯(表1)。健康與感病番茄土壤中電導(dǎo)率、NH4+-N、NO– 3-N、有效磷和全氮含量無顯著差異，但健康植株土壤中pH和全碳含量顯著高于感病植株土壤，速效鉀的含量顯著低于感病植株土壤。

表1 健康與感病番茄土體土壤基本理化性質(zhì)

注：表中同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示健康和感病番茄土體土壤間理化性質(zhì)差異達(dá)0.05顯著水平。

2.2 健康與感病番茄土壤細(xì)菌及青枯菌數(shù)量

熒光定量 PCR 結(jié)果表明，根際土壤中細(xì)菌和青枯菌的數(shù)量顯著高于土體土壤(0.05)，根際青枯菌的數(shù)量比土體青枯菌的數(shù)量高出 3 個(gè)數(shù)量級。健康番茄植株土體及根際土壤中細(xì)菌的數(shù)量分別顯著高于感病番茄植株土體及根際土壤，而健康番茄植株土體及根際土壤青枯菌數(shù)量顯著低于感病番茄植株土體及根際土壤(圖 1)。

2.3 健康與感病番茄土壤細(xì)菌群落測序數(shù)據(jù)總體概況

高通量原始序列經(jīng)過基本質(zhì)控過濾并去除古菌及低豐度序列后，16 個(gè)土壤樣品共有 856 374 條優(yōu)質(zhì)16S rRNA序列，其中最少的樣品有 38 449 條序列，而最多的樣品有 74 009 條序列。在 97% 相似度水平下，856 374 條序列共劃分為 3 452 個(gè) OTU，其中最少的樣品有 1 168 個(gè)OTU，而最多的樣品有 3 079 個(gè) OTU。與 RDP 數(shù)據(jù)庫比對后，856 374 條序列可歸類于 38 個(gè)細(xì)菌門，其中酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門及變形菌門為相對豐度最高的前 5 個(gè)門，占序列總數(shù)的 86.7%。

2.4 健康與感病番茄土壤細(xì)菌群落alpha多樣性

如圖2 所示，根際土壤中細(xì)菌群落的 alpha 多樣性指標(biāo)，如 Chao 及 Shannon 指數(shù)均顯著低于土體土壤(檢驗(yàn)，<0.05)。盡管健康番茄土體土壤豐富度 Chao 值顯著高于感病土壤，但健康及感病番茄根際土壤中 Chao 值無顯著差異。與之相反，盡管健康與感病番茄土體土壤多樣性 Shannon 指數(shù)無顯著差異，但健康番茄根際土壤中 Shanon 指數(shù)顯著高于感病番茄根際土壤。

2.5 健康與感病番茄土壤細(xì)菌群落beta多樣性

健康及感病番茄根際土壤細(xì)菌群落主坐標(biāo)成分在一軸上明顯區(qū)分于其土體土壤(圖 3)。健康番茄根際土壤細(xì)菌群落主成分在二軸上明顯區(qū)分于感病番茄根際土壤，盡管健康與感病番茄土體土壤細(xì)菌主成分差異不如根際土壤差異明顯，但健康番茄土體土壤細(xì)菌群落主成分仍明顯不同于感病番茄土體土壤。進(jìn)一步的 PerMANOVA 分析，也表明土壤類型(土體與根際)及土壤健康(健康與感病)均是細(xì)菌群落差異的顯著性驅(qū)動因素(Adonis 檢驗(yàn)，F(xiàn)土體vs根際= 40.8，土體vs根際= 0.001；健康vs感病= 6.7，健康vs感病= 0.009)。

2.6 健康與感病番茄土壤細(xì)菌群落組成差異

如圖 4 所示，與土體土壤相比，番茄根際土壤在細(xì)菌門水平上的組成類似，但門的相對豐度有所差異，如變形菌門的相對豐度顯著增高，而酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門及疣微菌門的相對豐度顯著降低(檢驗(yàn)，<0.05)。盡管健康與感病番茄土體土壤細(xì)菌主要門的相對豐度無顯著差異，但健康番茄根際土壤中擬桿菌門及疣微菌門的相對豐度顯著高于感病番茄根際土壤，而厚壁菌門、芽單胞菌門及變形菌門的相對豐度顯著低于感病番茄根際土壤(0.05)。

在屬水平上健康與感病番茄土體及根際土壤的組成較為類似。在土體土壤中共鑒定出 691 個(gè)屬，其中有 657 個(gè)屬(95.1%)共同存在于健康及感病番茄土體土壤中；在根際土壤中共鑒定出 615 個(gè)屬，其中有 476 個(gè)屬(77.5%)共同存在于健康及感病番茄根際土壤中。健康及感病番茄土壤中共有屬相對豐度的檢驗(yàn)結(jié)果表明：在健康與感病番茄土體土壤共有的 657 個(gè)屬中，健康番茄土體土壤中有 83 個(gè)屬的相對豐度顯著高于感病番茄土體土壤，而有 60 個(gè)屬的相對豐度顯著低于感病番茄土體土壤；在健康與感病番茄根際土壤共有的 476 個(gè)屬中，健康番茄根際土壤中有 32 個(gè)屬的相對豐度顯著高于感病番茄根際土壤，而有 60 個(gè)屬的相對豐度顯著低于感病番茄根際土壤(圖 5)。

健康番茄土體土壤中相對豐度顯著增加的 83 個(gè)屬及顯著降低的 60 個(gè)屬均歸類于酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門及部分低豐度門；而健康番茄根際土壤中相對豐度顯著降低的 60 個(gè)屬歸類于酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門及部分低豐度門，相對豐度顯著增加的 32 個(gè)屬歸類于擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門及部分低豐度門(圖 6)。其中，健康番茄根際顯著增加和降低的屬分別多屬于擬桿菌門和變形菌門。

如圖 7 所示，在健康番茄根際土壤中相對豐度顯著降低的變形菌門中，青枯病致病菌所在的青枯菌屬的相對豐度僅為 27.4%，顯著低于感病番茄根際土壤中青枯菌屬的相對豐度(54.6%)，而土體土壤之間無顯著差異。在健康番茄根際土壤中相對豐度顯著增加的擬桿菌門中，噬幾丁質(zhì)菌屬、金桿菌屬、動桿菌屬、黃桿菌屬及的相對豐度大于 1%，為優(yōu)勢菌屬，而土體土壤之間也無顯著差異。

3 討論

根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性及穩(wěn)定性決定著土壤和植物的健康以及生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性[18]。抑病型土壤指的是病原菌不能定殖，或能定殖但危害很小或沒有危害，或者能定殖并一時(shí)造成危害隨后即使在病原菌存在的情況下發(fā)病也很輕的土壤；而容易感病的土壤即為導(dǎo)病型土壤[19]。土著微生物群落或者特定種群具有抑制病原菌侵染植物的能力是抑病型土壤的關(guān)鍵因素[20-21]。本研究通過比較連作番茄田塊中健康番茄土壤(抑病型土壤)及感病番茄土壤(導(dǎo)病型土壤)細(xì)菌組成差異，利用高通量測序技術(shù)深入揭示了抑制土傳青枯病發(fā)生的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成特征。

與Li等[5]的研究結(jié)果類似，本研究中健康番茄土體及根際土壤細(xì)菌群落明顯不同于感病番茄土體及根際土壤，表明抑制土傳青枯病發(fā)生的土壤細(xì)菌群落確與感病土壤細(xì)菌群落不同。Garbeva等[22]研究表明，根際土壤細(xì)菌多樣性高能抑制土傳病害的發(fā)生，與之類似，本研究中健康番茄根際土壤細(xì)菌群落的Shannon多樣性指數(shù)更高，證實(shí)了細(xì)菌多樣性與生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力之間存在的正相關(guān)關(guān)系。

Li 等[5]利用454 焦磷酸測序技術(shù)研究番茄根際土壤細(xì)菌群落組成時(shí)發(fā)現(xiàn)番茄根際土壤細(xì)菌群落中變形菌門的相對豐度最高。本研究中根際細(xì)菌群落中變形菌門的相對豐度也占優(yōu)勢地位，可能是因?yàn)槠湎鄬^快的生長速率[23]。本研究結(jié)果表明，抑制番茄土傳青枯病發(fā)生的根際土壤中擬桿菌門的相對豐度顯著高于感病土壤。擬桿菌門通常棲居于土體土壤中，而且是微生態(tài)系統(tǒng)中相對穩(wěn)定的組分[24]。盡管擬桿菌門的相對豐度很少受土壤養(yǎng)分狀況的影響，但近年來越來越多的研究表明擬桿菌門可能與土壤抑病能力相關(guān)[25]。本研究中擬桿菌門所包含的噬幾丁質(zhì)菌屬、金桿菌屬、動桿菌屬、黃桿菌屬及均為抑制土傳青枯病發(fā)生的根際土壤中的優(yōu)勢菌屬(相對豐度>1%)，且與抑病能力密切相關(guān)。Liu 等[26]研究表明噬幾丁質(zhì)菌屬與番茄青枯病之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而Inderbitzin 等[27]研究發(fā)現(xiàn)西蘭花和幾丁質(zhì)混合物中接種噬幾丁質(zhì)菌屬可提升土壤抑制輪枝菌侵染誘發(fā)的黃萎病的能力。金桿菌屬已被成功分離并應(yīng)用于辣椒疫病的生物防治[28]。Kwak 等[25]研究表明，黃桿菌屬在番茄根際土壤抵御青枯病侵染的過程中發(fā)揮重要作用。盡管尚未有直接證據(jù)表明其具有生防功能，但近年來的研究表明動桿菌屬及在健康土壤中的相對豐度較高，可能也與抑病相關(guān)[29]。此外，本研究中健康番茄根際土壤中無論是青枯菌屬的相對豐度還是絕對數(shù)量雖顯著低于感病根際土壤，但仍屬于較高水平，說明健康根際的整體細(xì)菌群落對于提升土壤抑病能力也具有一定的作用。

土壤微生物的裝配受植物基因型和土壤狀況等共同影響[30]。盡管感病與健康樣品在同一設(shè)施大棚內(nèi)采集，但可能因土壤的異質(zhì)性、施肥的不均勻、灌溉不均勻以及與作物互作關(guān)系不一致等原因，導(dǎo)致健康與感病土壤樣品的部分理化性狀有顯著差異。本研究中，抑制土傳青枯病發(fā)生的土壤擁有較高的pH及全碳含量。Deltour等[31]研究發(fā)現(xiàn)高土壤pH能增強(qiáng)土壤抑鐮刀菌枯萎病能力。土壤pH不僅能通過作用于病原菌或其他微生物直接影響土壤抑病型能力，還能通過影響土壤速效養(yǎng)分間接影響土壤抑病型能力[32]。此外，土壤全碳含量高通常預(yù)示著土壤有機(jī)質(zhì)含量較高，而有機(jī)質(zhì)含量較高的土壤中通常微生物生物量及活力也較高，也能在抑病過程中發(fā)揮重要作用[22]。Satoh和Toyota[33]研究證實(shí)提升土壤中有機(jī)質(zhì)含量可降低土壤中青枯菌的數(shù)量，進(jìn)而提升土壤抑制青枯病的能力。總而言之，提升土壤pH及全碳(有機(jī)質(zhì))含量，不僅可直接降低土壤中青枯菌，還可通過調(diào)控土體土壤微生物組成，進(jìn)而影響根際微生物群落裝配，并最終決定群落整體的抑病能力。

微生物、土壤及植物之間的互作關(guān)系非常復(fù)雜，影響了植物地下部微生物組成及生態(tài)系統(tǒng)功能，進(jìn)而決定了地上部植物的生長與健康。本研究借助MiSeq高通量測序技術(shù)利用全面的分析比較了同一連作田塊中健康與患病番茄土體及根際土壤細(xì)菌群落的組成特征，結(jié)果表明，相較于感病土壤，健康土壤中pH及有機(jī)質(zhì)含量較高，其棲居的細(xì)菌群落組成特異，所種植的番茄從土壤中招募微生物裝配形成的根際細(xì)菌群落多樣性高，且富集了噬幾丁質(zhì)菌屬、金桿菌屬、動桿菌屬、黃桿菌屬及等土著有益微生物，不僅有效降低了根際土壤中青枯病的相對豐度，還提升了群落整體抑病能力。但番茄如何招募這些有益微生物在根際進(jìn)行裝配將是未來研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

[1] 賀紀(jì)正, 李晶, 鄭袁明.土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性-穩(wěn)定性關(guān)系的思考[J].生物多樣性, 2013, 21(4): 411–420

[2] Berendsen R L, Pieterse C M J, Bakker P A H M. The rhizosphere microbiome and plant health[J]. Trends in Plant Science, 2012, 17(8): 478–486.

[3] Hassani M A, Durán P, Hacquard S. Microbial interactions within the plant holobiont[J]. Microbiome, 2018, 6: 58.

[4] Khan S, Hanjra M A, Mu J X. Water management and crop production for food security in China: a review[J]. Agricultural Water Management, 2009, 96(3): 349–360.

[5] Li J G, Ren G D, Jia Z J, et al. Composition and activity of rhizosphere microbial communities associated with healthy and diseased greenhouse tomatoes[J]. Plant and Soil, 2014, 380(1/2): 337–347.

[6] 韋中. 生物有機(jī)肥防控土傳番茄青枯病的效果及其機(jī)制研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[7] Raaijmakers J M, Paulitz T C, Steinberg C, et al. The rhizosphere: A playground and battlefield for soilborne pathogens and beneficial microorganisms[J]. Plant and Soil, 2009, 321(1/2): 341–361.

[8] 張鵬, 韋中, 朱震, 等. 生物有機(jī)肥對連作番茄和辣椒根際土壤微生物區(qū)系及茄科雷爾氏菌的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 36(4): 77–82.

[9] Wei Z, Yang X M, Yin S X, et al. Efficacy of Bacillus-fortified organic fertiliser in controlling bacterial wilt of tomato in the field[J]. Applied Soil Ecology, 2011, 48(2): 152–159.

[10] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析(第3版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000.

[11] 楊尚東, 趙久成, 郭伊娟, 等. 番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的初步分析[J]. 中國蔬菜, 2014(8): 25–29.

[12] Fierer N, Jackson J A, Vilgalys R, et al. Assessment of soil microbial community structure by use of taxon-specific quantitative PCR assays[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(7): 4117–4120.

[13] Sch?nfeld J, Heuer H, van Elsas J D, et al. Specific and sensitive detection of Ralstonia solanacearum in soil on the basis of PCR amplification of fliC fragments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(12): 7248–7256.

[14] Caporaso J G, Lauber C L, Walters W A, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample[J]. PNAS, 2011, 108(Supplement_1): 4516–4522.

[15] Edgar R C. UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 996–998.

[16] Wang Q, Garrity G M, Tiedje J M, et al. Na?ve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261–5267.

[17] Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, et al. Introducing mothur: Open-source, platform-independent, community- supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(23): 7537–7541.

[18] Trivedi P, He Z L, van Nostrand J D, et al. Huanglongbing alters the structure and functional diversity of microbial communities associated with citrus rhizosphere[J]. The ISME Journal, 2012, 6(2): 363–383.

[19] 張瑞福, 沈其榮.抑病型土壤的微生物區(qū)系特征及調(diào)控[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 35(5): 125–132.

[20] Weller D M, Raaijmakers J M, Gardener B B M, et al. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40(1): 309–348.

[21] Mendes R, Kruijt M, de Bruijn I, et al. Deciphering the rhizosphere microbiome for disease-suppressive bacteria[J]. Science, 2011, 332(6033): 1097–1100.

[22] Garbeva P, van Veen J A, van Elsas J D. Microbial diversity in soil: Selection of microbial populations by plant and soil type and implications for disease suppressiveness[J]. Annual Review of Phytopathology, 2004, 42(1): 243–270.

[23] Fierer N, Bradford M A, Jackson R B. Toward an ecological classification of soil bacteria[J]. Ecology, 2007, 88(6): 1354–1364.

[24] Yergeau E, Schoondermark-Stolk S A, Brodie E L, et al. Environmental microarray analyses of Antarctic soil microbial communities[J]. The ISME Journal, 2009, 3(3): 340–351.

[25] Kwak M J, Kong H G, Choi K, et al. Rhizosphere microbiome structure alters to enable wilt resistance in tomato[J]. Nature Biotechnology, 2018, 36(11): 1100– 1109.

[26] Liu H J, Xiong W, Zhang R F, et al. Continuous application of different organic additives can suppress tomato disease by inducing the healthy rhizospheric microbiota through alterations to the bulk soil microflora[J]. Plant and Soil, 2018, 423(1/2): 229–240.

[27] Inderbitzin P, Ward J, Barbella A, et al. Soil microbiomes associated with verticillium wilt-suppressive broccoli and chitin amendments are enriched with potential biocontrol agents[J]. Phytopathology, 2018, 108(1): 31–43.

[28] Kim H S, Sang M K, Jung H W, et al. Identification and characterization of Chryseobacterium wanjuense strain KJ9C8 as a biocontrol agent of Phytophthora blight of pepper[J]. Crop Protection, 2012, 32: 129–137.

[29] Fu L, Penton C R, Ruan Y Z, et al. Inducing the rhizosphere microbiome by biofertilizer application to suppress banana Fusarium wilt disease[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 104: 39–48.

[30] Lundberg D S, Lebeis S L, Paredes S H, et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome[J]. Nature, 2012, 488(7409): 86–90.

[31] Deltour P, C Fran?a S, Liparini Pereira O, et al. Disease suppressiveness to Fusarium wilt of banana in an agroforestry system: Influence of soil characteristics and plant community[J]. Agriculture, Ecosystems & Environ-ment, 2017, 239: 173–181.

[32] 彭雙, 王一明, 葉旭紅, 等. 土壤環(huán)境因素對致病性尖孢鐮刀菌生長的影響[J]. 土壤, 2014, 46(5): 845–850.

[33] Satoh K, Toyota K. Comparison of disease suppressiveness of different soils with or without repeated application of organic matters toward bacterial wilt of tomato caused by ralstonia solanacearum[J]. Microbes and Environments, 2004, 19(4): 310–314.

Comparison of Bacterial Communities in Bulk and Rhizosphere Soils of Healthy and Diseased Tomato Infected by Bacterial Wilt

SHEN Zongzhuan1, HUANG Yan1, CAO Yifan1, WANG Dongsheng1,2, LIU Hongjun1, LI Rong1*, SHEN Qirong1

(1 College of Resources and Environmental Sciences, Jiangsu Provincial Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization, Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizers, Key Laboratory of Plant Immunity, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2 Nanjing Institute of Vegetable Science, Nanjing 210042, China)

In this study, real time PCR and MiSeq sequencing technology was used to deeply compare the differences of bacterial community structures and compositions in bulk and rhizosphere soils of healthy and diseased tomato-planting fields under mono-cropping system. The results showed that healthy bulk soil displayed higher pH value and total carbon content. The bacterial structures and compositions in healthy bulk and rhizosphere soils were obviously different from those of diseased ones. Compared to diseased rhizosphere soil, healthy rhizosphere soil exhibited a significant higher number of total bacteria and a significant lower number of. Also, healthy rhizosphere soil showed a significant higher index of Shannon diversity. Furthermore, the relative abundance of Bacteroides and,,,andincluded in Bacteroides was significantly enriched while the relative abundance of Proteobacteria andincluded in Proteobacteria was significantly depleted in healthy rhizosphere soil compared to diseased one. In summary, soil suppressive to tomato bacterial wilt disease harbored a unique bacterial community, which showed high bacterial population, diversity and relative abundance of beneficial indigenous microorganisms and low relative abundance of pathogen. This research could provide a guideline and theoretical principle for biological control of tomato bacterial wilt disease.

Tomato wilt disease; Disease-suppressive soil; High-throughput sequencing; Bacterial community diversity; Bacterial community composition

S154

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.002

沈宗專, 黃炎, 操一凡, 等. 健康與罹患青枯病的番茄土壤細(xì)菌群落特征比較. 土壤, 2021, 53(1): 5–12.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41977044)、江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20160710)和江蘇省政策引導(dǎo)類計(jì)劃(國際科技合作/港澳臺科技合作)項(xiàng)目(BZ2020026)資助。

(lirong@njau.edu.cn)

沈宗專(1987—)，男，江蘇寶應(yīng)人，博士，副教授，主要從事土壤微生物與生物肥料研究。E-mail: victorshenzz@163.com